張君威，唐志書，劉妍如，宋忠興，周 瑞，潘亞磊，劉紅波，史鑫波，張玉茹，趙夢(mèng)利

正源方干預(yù)化療后白細(xì)胞減少癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

張君威，唐志書*，劉妍如*，宋忠興，周 瑞，潘亞磊，劉紅波，史鑫波，張玉茹，趙夢(mèng)利

陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西省中藥產(chǎn)業(yè)研究院，陜西 咸陽 712083

根據(jù)正源方具有緩解化療后患者白細(xì)胞降低的藥理作用，分析正源方的化學(xué)成分，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。使用UPLC-TOF/MS技術(shù)檢測正源方的主要化學(xué)成分，在數(shù)據(jù)庫中檢索主要化學(xué)成分作用靶點(diǎn)和白細(xì)胞減少癥相關(guān)靶點(diǎn)，用韋恩圖得到交集靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖和“中藥-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出度值高的關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)上傳R軟件進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。將SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組［地榆升白片0.11 g/(kg?d)］、正源方高劑量組［2.73 g/(kg?d)］、中劑量組［1.37g/(kg?d)］、低劑量組［0.68g/(kg?d)］，除空白組外，各組大鼠ip環(huán)磷酰胺［40 mg/(kg?d)］4 d誘導(dǎo)白細(xì)胞減少癥大鼠模型，測定白細(xì)胞數(shù)、臟器指數(shù)，ELISA試劑盒檢測腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的含量。使用UPLC-TOF/MS技術(shù)共測得24個(gè)化學(xué)成分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，正源方的活性成分作用于377個(gè)靶點(diǎn)，檢索到疾病相關(guān)靶點(diǎn)1952個(gè)，交集靶點(diǎn)124個(gè)。篩選得出人參皂苷Rg1、阿魏酸、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Ro、山柰酚等核心成分；TNF和IL-6等共20個(gè)重要靶點(diǎn)，富集到的關(guān)鍵通路有IL-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，與模型組相比，正源方高、中劑量給藥組的大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高，血清中TNF-α、IL-6水平顯著降低（＜0.05），能夠減輕白細(xì)胞減少癥大鼠脾臟和胸腺組織的病理損傷。正源方治療白細(xì)胞減少癥的物質(zhì)基礎(chǔ)是以人參皂苷為主的化學(xué)成分，相關(guān)作用機(jī)制具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

正源方；環(huán)磷酰胺；骨髓抑制；白細(xì)胞減少癥模型；西洋參；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

化療是治療惡性腫瘤的主要方法，大多數(shù)抗腫瘤藥物通過抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長來發(fā)揮作用，因此，在化療過程中患者的不良反應(yīng)以骨髓抑制為主。骨髓抑制的發(fā)病機(jī)制與造血干細(xì)胞的衰老、凋亡及骨髓造血微環(huán)境的損傷有關(guān)[1]。骨髓抑制的首發(fā)表現(xiàn)為白細(xì)胞減少，當(dāng)白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于4×109/L時(shí)，患者在臨床上會(huì)表現(xiàn)出乏力、發(fā)熱、面色蒼白、免疫力下降等癥狀，常致化療中斷或延遲[2]。

臨床上主要使用粒細(xì)胞集落刺激因子、鯊肝醇、利血生等藥物治療白細(xì)胞減少癥，但這些藥物有價(jià)格昂貴和副作用多的缺點(diǎn)[3-4]。近年來，中藥復(fù)方、單體及中成藥在防治骨髓抑制方面的研究逐漸增多，其療效顯著，毒副作用小，價(jià)格相對(duì)較低，越來越多地被臨床采納[5]。中醫(yī)認(rèn)為白細(xì)胞減少癥患者所表現(xiàn)的神疲乏力、少氣懶言、脈虛無力等癥狀，可歸屬于“虛勞”范疇，故臨床常采用益氣、養(yǎng)血、滋陰的治療方法[6-7]。根據(jù)以上研究進(jìn)展，陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科基于益氣養(yǎng)陰、養(yǎng)血補(bǔ)血、清熱解毒、扶正祛邪的治則，充分吸納“當(dāng)歸補(bǔ)血湯”“沙參麥門冬湯”兩首經(jīng)典方的組方配伍規(guī)律及其適用特點(diǎn)，以西洋參、仙鶴草、當(dāng)歸、南沙參、重樓組成了正源方，臨床實(shí)踐證明該方適合于放、化療所致的陰虛熱毒，癥見骨髓抑制、血細(xì)胞減少，對(duì)改善化療后外周血象變化，升高白細(xì)胞具有一定作用。

中藥復(fù)方遵循“君臣佐使、七情配伍”原則，其成分復(fù)雜，各成分之間相互協(xié)同或拮抗，作用于多個(gè)靶點(diǎn)，通過多種途徑發(fā)揮藥效[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有系統(tǒng)性和整體性的特點(diǎn)，被廣泛用于篩選中藥有效成分、闡釋作用機(jī)制等[9]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析正源方干預(yù)白細(xì)胞減少癥可能影響的信號(hào)通路和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。此外，構(gòu)建白細(xì)胞減少癥大鼠模型，檢測相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)正源方緩解白細(xì)胞減少癥的作用，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到的靶點(diǎn)進(jìn)行初步驗(yàn)證。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Acquity H-CLASS型超高效液相色譜（UPLC，美國沃特世科技有限公司）串聯(lián)Triple TOFTM5600+質(zhì)譜儀（美國愛博才思公司），液相配置：二元超高壓溶劑系統(tǒng)、FTN自動(dòng)進(jìn)樣管理器、PDA檢測器和Empower3色譜工作站；Sartorius CPA225D型十萬分之一電子分析天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；Thermo Micro17R微量低溫冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific有限公司；BC-5300獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；Thermo1510型全波長酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；Eclipse Ci-L正置白光拍照顯微鏡，日本Nikon公司；Pannoramic DESK/MIDI/250/1000全景切片掃描儀，匈牙利3DHISTECH公司；Donatello脫水機(jī)，意大利Diapath公司；JB-P型生物組織包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司；JB-L5型凍臺(tái)，武漢俊杰電子有限公司；RM2016型病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；KD-P型組織攤片機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；GFL-230型烤箱，津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試劑與材料

甲醇，分析純，批號(hào)2018101801，成都市科隆化學(xué)品有限公司；乙腈（批號(hào)JA104530）、甲醇（批號(hào)I1077207008），色譜純，德國默克公司；甲酸（LC/MS），批號(hào)205775，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；環(huán)磷酰胺一水合物，批號(hào)C0768-1G，Sigma公司；大鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)R210312-003a）、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)R210312-102a），欣博盛生物科技有限公司；防脫載玻片，武漢賽維爾生物科技有限公司。

正源方全方水提液粉末（實(shí)驗(yàn)室自制），方中5味中藥飲片的批號(hào)和產(chǎn)地分別為西洋參，批號(hào)20190701，產(chǎn)地吉林；仙鶴草，批號(hào)20190501，產(chǎn)地陜西；當(dāng)歸，批號(hào)20181201，產(chǎn)地甘肅；南沙參，批號(hào)20181101，產(chǎn)地江蘇；重樓，批號(hào)20190102，產(chǎn)地云南，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍教授鑒定，分別為五加科植物西洋參L.的干燥根、薔薇科植物龍芽草Ledeb.的干燥地上部分、傘形科植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根、桔梗科植物沙參Miq.的干燥根、百合科植物云南重樓Smith var.(Franch.) Hand. -Mazz.的干燥根莖。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為180～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（陜）2018-001。環(huán)境溫度（23±2）℃，濕度（50±10）%，12 h光/暗循環(huán)（光照時(shí)間8:30～20:30），自由進(jìn)食飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前每天給予連續(xù)5 min的撫摸適應(yīng)，1周后大鼠隨機(jī)分組。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC/Q-TOF-MS/MS檢測正源方成分

2.1.1 供試品溶液的制備 取正源方粉末（過三號(hào)篩）樣品約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液離心，離心條件為12 000 r/min，10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，正、負(fù)離子模式下源噴射電壓（ionspray voltaage floating，IVF）分別為5500、?4500 V，裂解電壓（declustering potential，DP）為±80 V，碰撞能量（collision energy，CE）為±10 eV，霧化氣（ion source gas 1，GS1）和輔助氣（ion source gas 2，GS2）為氮?dú)?，皆?44.74 kPa（50 psi），氣簾氣（curtain gas，CUR）241.32 kPa（35 psi），霧化溫度（temperature，TEM）500 ℃，采用信息依賴采集（IDA），動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）和高靈敏度模式采集數(shù)據(jù)，母離子（TOF-MS）掃描范圍/100～2000，子離子掃描范圍為/100～2000。

2.1.3 液相色譜條件 采用Acquity UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，使用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，液相洗脫梯度：0～10 min，2%乙腈；10～15 min，2%～5%乙腈；15～20 min，5%～15%乙腈；20～25 min，15%～20%乙腈；25～45 min，20%～35%乙腈；45～55 min，35%～45%乙腈；55～60 min，45%～2%乙腈；60～63 min，2%乙腈；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

2.1.4 UPLC/Q-TOF-MS/MS檢測結(jié)果 將檢測得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView 2.2軟件對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，圖譜結(jié)果見圖1，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，共分析得24個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見表1[10-20]。

2.2 正源方干預(yù)白細(xì)胞減少癥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 化學(xué)成分和疾病交集靶點(diǎn)篩選 以“2.1.4”項(xiàng)中成分鑒別結(jié)果為基礎(chǔ)，整理正源方中主要化學(xué)成分，并在數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)中檢索化學(xué)成分作用的靶點(diǎn)[21-25]。使用的數(shù)據(jù)庫有ETCM（http://www. tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/index.html）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction. ch/）、Pharmmapper（http://www.lilab-ecust.cn/ pharmmapper/）。共檢索到524個(gè)靶點(diǎn)，其中西洋參143個(gè)、仙鶴草136個(gè)、當(dāng)歸198個(gè)、南沙參5個(gè)、重樓42個(gè)，去除重復(fù)后得到377個(gè)。同時(shí)，在ETCM、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Gene Cards（https:// www.genecards.org/）、Malacards（https://www. malacards.org/）中以“l(fā)eukopenia”（白細(xì)胞減少癥）為關(guān)鍵詞檢索到1952個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將上述靶點(diǎn)上傳至Venny 2.1.0網(wǎng)站（https://bioinfogp.cnb.csic. es/tools/ venny/index.html），繪制韋恩圖，提取到126個(gè)交集靶點(diǎn)，再通過Uniport網(wǎng)站（https://www. uniport.org）校正ID后得124個(gè)靶點(diǎn)，結(jié)果見圖2。

1-沒食子酸 2-兒茶素 3-阿魏酸 4-鞣花酸 5-金絲桃苷 6-木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 7-槲皮苷 8-芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 9-人參皂苷Rg1 10-人參皂苷Rd 11-人參皂苷Re 12-山柰酚 13-原薯蕷皂苷 14-擬人參皂苷F11 15-人參皂苷F2 16-人參皂苷Rg2 17-人參皂苷Rb1 18-人參皂苷Rb2 19-人參皂苷Ro 20-重樓皂苷I 21-β-蛻皮激素 22-重樓皂苷VI 23-藁本內(nèi)酯 24-歐當(dāng)歸內(nèi)酯A

2.2.2 “中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將124個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0（https://string-db.org/），以人類（homo sapiens）為種屬，查詢蛋白相互作用信息，將得到的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。將PPI生成的互作信息結(jié)果，與“中藥-化學(xué)成分”和“化學(xué)成分-靶點(diǎn)”信息進(jìn)行映射關(guān)聯(lián)，把關(guān)聯(lián)表格導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”預(yù)測互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），使用Network analysis插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和邊的特征。圖中包括154個(gè)節(jié)點(diǎn)（5種中藥，25個(gè)成分，124個(gè)靶點(diǎn)）和2868條邊，用節(jié)點(diǎn)大小表示度值的大小，度值的大小代表該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，接近中心度的大小表示節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的中心度。在互作網(wǎng)絡(luò)中，度值和接近中心度最大的中藥是西洋參（度值＝216，接近中心 度＝0.39），度值和接近中心度較大的化學(xué)成分是人參皂苷Rg1（度值＝62，接近中心度＝0.53）、阿魏酸（度值＝50，接近中心度＝0.52）、人參皂苷Rb1（度值＝48，接近中心度＝0.51）、人參皂苷Rg2（度值＝44，接近中心度＝0.51）、人參皂苷Ro（度值＝42，接近中心度＝0.51）、山柰酚（度值＝40，接近中心數(shù)＝0.50）等，根據(jù)度值和接近中心度的數(shù)值篩選，排名前10的靶點(diǎn)詳見表2。

表1 TOF成分表征結(jié)果

圖2 正源方化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 “中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”圖

表2 “中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中主要靶點(diǎn)信息

2.2.3 GO和KEGG富集分析 使用R4.0.3軟件中的clusterProfiler包對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG的富集分析，結(jié)果見圖5。GO分析結(jié)果顯示，細(xì)胞成分（cellular component，CC）提示交集靶點(diǎn)主要分布于膜筏、膜微域、膜區(qū)等；分子功能（molecular function，MF）涉及聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等；生物過程（biological process，BP）與對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)控等相關(guān)。以KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)基因參與的主要生化代謝途徑進(jìn)行富集和注釋，顯著性差異設(shè)定卡值為＜0.05，并對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理，KEGG富集到的相關(guān)通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路等。

2.2.4 “信號(hào)通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 將KEGG富集到的前20條通路進(jìn)行篩選，排除與病毒、癌癥相關(guān)的通路，篩選到與白細(xì)胞減少癥相關(guān)的通路6條，分別為PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、IL-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、C型凝集素受體信號(hào)通路（C-type lectin receptor signaling pathway）。將通路與該通路上富集到的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“信號(hào)通路-靶點(diǎn)”圖（圖6）。經(jīng)過Network Analyzer插件計(jì)算得度值排名前10的靶點(diǎn)見表3，這些靶點(diǎn)在通路上較為重要。綜合“2.2.2”的結(jié)果，“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”和“信號(hào)通路-靶點(diǎn)”兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖上度值排名前10的靶點(diǎn)中，共有靶點(diǎn)是IL-6和TNF，推測這2個(gè)靶點(diǎn)在正源方干預(yù)白細(xì)胞減少癥上的作用最為關(guān)鍵。將篩選出的20個(gè)度值高的靶點(diǎn)在信號(hào)通路上溯源，IL-17信號(hào)通路上具有的靶點(diǎn)最多，并且IL-6和TNF也與IL-17信號(hào)通路有關(guān)，該條通路可以是正源方治療白細(xì)胞減少癥所調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路。

圖6 “信號(hào)通路-靶點(diǎn)”圖

表3 信號(hào)通路上靶點(diǎn)相關(guān)信息

2.3 正源方對(duì)白細(xì)胞減少癥大鼠模型作用研究

2.3.1 模型制備 運(yùn)用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)大鼠白細(xì)胞減少癥的模型來模擬人體接受化療后的狀態(tài)，根據(jù)文獻(xiàn)檢索以及預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索結(jié)果，確定造模用劑量和給藥劑量[26-28]。大鼠適應(yīng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥（地榆升白片）組及正源方高、中、低劑量給藥組，共6組，每組10只。其中，空白組注射生理鹽水，模型組和給藥組按環(huán)磷酰胺40 mg/(kg?d)的劑量ip 4 d，進(jìn)行模型復(fù)制，觀察到大鼠的外周白細(xì)胞下降即造模成功。造模結(jié)束后，按照陽性藥組0.11 g/(kg?d)，正源方高劑量組2.73 g/(kg?d)、中劑量組1.37 g/(kg?d)、低劑量組0.68 g/(kg?d)的劑量給藥，每日ig 1次，共給藥10 d。

2.3.2 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料差異比較采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），多重比較方法選擇LSD方法，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3 白細(xì)胞計(jì)數(shù)變化情況 從造模前開始檢測血常規(guī)，觀察實(shí)驗(yàn)過程中大鼠的白細(xì)胞數(shù)值變化情況，共測4次，結(jié)果如表4所示。在造模之前，大鼠的白細(xì)胞值在正常范圍，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；造模結(jié)束后第1天（第5天），與空白組相比，模型組大鼠的白細(xì)胞數(shù)值顯著降低至2×109/L以下（＜0.01），表明模型復(fù)制成功，由于此時(shí)暫未給藥，因此，與模型組相比，各給藥組無顯著差異；給藥5天后（第10天），與空白組相比，模型組大鼠的白細(xì)胞值顯著降低（＜0.01），與模型組相比，各給藥組白細(xì)胞值顯著升高（＜0.05、0.01），其中高劑量和中劑量給藥組恢復(fù)情況較好；給藥結(jié)束（第15天），與空白組相比，模型組大鼠的白細(xì)胞值顯著降低（＜0.01），與模型組相比，各給藥組白細(xì)胞值均顯著升高（＜0.01），其中陽性藥組，正源方高、中劑量組恢復(fù)情況較好。血常規(guī)檢測結(jié)果說明，陽性藥和正源方各給藥組對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠白細(xì)胞的降低有顯著的恢復(fù)作用。

2.3.4 臟器指數(shù) 給藥結(jié)束后，禁食24 h，將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，制備血清，解剖取臟器，生理鹽水沖洗后吸干臟器表面水分，稱定質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。結(jié)果如表5所示，與空白組相比，模型組大鼠脾臟指數(shù)顯著增高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大鼠脾臟指數(shù)顯著升高（＜0.05、0.01），造模使大鼠脾臟腫大，且給藥組無明顯恢復(fù)作用。與空白組相比，模型組大鼠胸腺指數(shù)顯著降低（＜0.01），環(huán)磷酰胺造模造成了胸腺的退行性病變，與模型組相比，正源方高劑量和中劑量組可以顯著提高胸腺指數(shù)（＜0.01），陽性藥組以及低劑量組有所升高，但無顯著差異，可能在該劑量下，胸腺指數(shù)提高不明顯。臟器指數(shù)結(jié)果說明，正源方高劑量和中劑量組對(duì)白細(xì)胞減少癥模型大鼠的胸腺指數(shù)下降具有一定的恢復(fù)作用。

表4 大鼠不同時(shí)期白細(xì)胞計(jì)數(shù)變化(, n = 6)

與空白組比較：**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，下表同

P< 0.01control group;P< 0.05##< 0.01model group, same as below tables

表5 各組大鼠臟器指數(shù)(, n = 6)

2.3.5 正源方對(duì)白細(xì)胞減少癥模型大鼠脾臟和胸腺病理學(xué)的影響 對(duì)大鼠臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查，使用4%多聚甲醛固定臟器，將目的部位組織修平整后，依次進(jìn)行梯度酒精脫水，將浸好蠟的組織包埋，冷卻，再用石蠟切片機(jī)切片，厚4mm，切片漂浮于攤片機(jī)40 ℃溫水上，60 ℃烘箱內(nèi)烤片，常溫保存?zhèn)溆?。觀察結(jié)果如圖7所示，空白組脾臟白髓與紅髓分界尚清晰，白髓結(jié)構(gòu)完整，邊緣區(qū)清晰，脾小結(jié)多見生發(fā)中心，脾小梁未見明顯異常，與空白組相比，模型組脾臟白髓損傷，結(jié)構(gòu)消失，淋巴細(xì)胞大量減少，脾小梁減少，結(jié)構(gòu)松解、消失，與模型組相比，陽性藥組脾臟的白髓殘留個(gè)別體積明顯變小的輪廓，正源方高、中劑量組能減輕脾臟白髓的損傷，使其殘留少量的輪廓，紅髓可見髓外造血細(xì)胞?？瞻捉M胸腺的小葉由含有大量小淋巴細(xì)胞的皮質(zhì)和含有較多的上皮細(xì)胞的髓質(zhì)組成，分界清晰，皮質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)量豐富，排列密集，與空白組相比，模型組胸腺組織萎縮，體積明顯變小，皮髓質(zhì)分界模糊，淋巴細(xì)胞大量消失，與模型組相比，陽性藥組胸腺的皮髓質(zhì)分界較模糊，皮質(zhì)染色變淺，淋巴細(xì)胞數(shù)量輕度減少，正源方高、中劑量組胸腺組織被膜未見明顯異常，皮髓質(zhì)分界清晰，淋巴細(xì)胞排列緊密。

2.3.6 正源方對(duì)大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的影響 使用雙抗體夾心法ELISA試劑盒檢測大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量，結(jié)果如表6所示。與空白組相比，模型組大鼠血清中的TNF-α、IL-6含量顯著升高（＜0.01），與模型組相比，各給藥組TNF-α含量均顯著降低（＜0.01）。正源方給藥組對(duì)白細(xì)胞減少癥模型大鼠血清中TNF-α、IL-6的含量有一定的影響，可以通過調(diào)節(jié)這2個(gè)靶點(diǎn)起到干預(yù)白細(xì)胞減少癥的作用。

3 討論

正源方處方由西洋參、仙鶴草、當(dāng)歸，南沙參和重樓組成，方中重用西洋參，滋陰補(bǔ)氣，養(yǎng)胃生津，為君藥；仙鶴草收斂止血，有止血及升血小板的能力，為臣藥；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，南沙參養(yǎng)陰清熱，二者同為佐藥；重樓清熱解毒、消腫止痛，有使藥之效。諸藥合用，各奏其效，主治證候明確，共奏益氣養(yǎng)陰、養(yǎng)血補(bǔ)血、清熱解毒、扶正祛邪之效，使用具有安全性和有效性[29]，臨床上對(duì)白細(xì)胞減少癥有療效。本研究使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒別出正源方中24個(gè)關(guān)鍵的化學(xué)成分，包括黃酮類以及人參皂苷類成分。結(jié)合主要化學(xué)成分作用靶點(diǎn)和疾病的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，通過“中藥-成分-靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò)圖篩選得到度值較高的活性成分有人參皂苷Rg1、阿魏酸、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg2、人參皂苷Ro、山柰酚等。其中人參皂苷Rg1可以促進(jìn)輻射后小鼠造血功能的恢復(fù)，并升高小鼠白細(xì)胞數(shù)值[30]；阿魏酸可恢復(fù)骨髓抑制小鼠白細(xì)胞和骨髓造血組織面積[31]；人參皂苷Rb1能提高腫瘤模型小鼠的免疫功能，并拮抗5-氟脲嘧啶對(duì)免疫功能的抑制作用[32]；人參皂苷Ro可以提高白血病來源樹突狀細(xì)胞抗原提呈及活化適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能[33]；山柰酚能增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞活力，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，加強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答[34]，這幾種成分可能是正源方發(fā)揮治療作用的主要藥效成分。

圖7白細(xì)胞減少癥模型大鼠脾臟(×20)和胸腺(×2) 病理切片

表6 正源方對(duì)白細(xì)胞減少癥模型大鼠血清TNF-α、IL-6含量的影響(, n = 6)

正源方中的活性成分可通過多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮治療白細(xì)胞減少癥的作用，其中關(guān)鍵的靶點(diǎn)是IL-6和TNF等共20個(gè)。IL-6和TNF-α是重要的促炎因子，會(huì)破壞骨髓造血的微環(huán)境，導(dǎo)致骨髓抑制，抑制造血干細(xì)胞增殖分化[35]。IL-6也是一種對(duì)免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要的細(xì)胞因子，在先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫中的重要作用[36]。當(dāng)IL-1、IL-6和TNF-a這些因子激活抗體后，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并分泌G-CSF和GM-CSF，可用于治療白細(xì)胞減少癥[37]。IL-6可刺激B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體，促進(jìn)原始T細(xì)胞向Th17分化，使IL-21、IL-17等因子分泌增加，從而調(diào)節(jié)腫瘤生長等病理過程[38]。IL-6主要與淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞在內(nèi)的白細(xì)胞的生長和分化有關(guān)，因此測定其在血清中的含量[39]。有研究制備黑色素瘤小鼠模型，運(yùn)用生白湯聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療后，血清中IL-6含量會(huì)降低[40]，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)白細(xì)胞減少癥模型后血清IL-6水平顯著升高[41]。TNF-α可激活巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞，提進(jìn)血小板激活因子、NO、前列腺素和白細(xì)胞三烯等的產(chǎn)生，它們相互作用引起炎性介質(zhì)過度釋放，加重組織器官的損害[42]。在本研究中，與空白組相比，模型組IL-6和TNF-α在血清中的含量顯著增高，說明白細(xì)胞減少癥會(huì)引起這2個(gè)因子的活化，然而，與模型組相比，正源方給藥組對(duì)模型大鼠血清中升高的TNF-α、IL-6含量有顯著降低作用。

由通路富集結(jié)果可知，正源方的活性成分可能主要作用于IL-17信號(hào)通路，IL-17誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞，這種作用是通過非造血靶細(xì)胞產(chǎn)生GCSF、MCP-1和CXC趨化因子間接實(shí)現(xiàn)的，IL-17缺乏與中性粒細(xì)胞活性降低有關(guān)[43]。有研究證實(shí)IL-17可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6，TNF-α和IL-6通過下調(diào)TLR2介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化使NF-kB激活，產(chǎn)生進(jìn)一步作用[44]。目前，正源方治療白細(xì)胞減少癥所涉及的相關(guān)通路還有待進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

此外，本實(shí)驗(yàn)中制備動(dòng)物模型，觀察正源方對(duì)白細(xì)胞減少癥模型大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)正源方高、中劑量給藥組可以顯著升高大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)和胸腺指數(shù)，并且減輕由于造模導(dǎo)致脾臟和胸腺組織的病理損傷。本研究體現(xiàn)了正源方干預(yù)化療后引起的白細(xì)胞減少癥具有多成分，多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，為正源方的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Network pharmacology study on Zhengyuan Prescription’s intervention in leukopenia after chemotherapy and experimental verification

ZHANG Jun-wei, TANG Zhi-shu, LIU Yan-ru, SONG Zhong-xing, ZHOU Rui, PAN Ya-lei, LIU Hong-bo, SHI Xin-bo, ZHANG Yu-ru, ZHAO Meng-li

Shaanxi Institute of Traditional Chinese Medicine Industry, Shaanxi Research Center of Innovative Drug, Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083, China

According to the pharmacological effects of alleviating patient’s leukopenia after chemotherapy of Zhengyuan Prescription (正源方), the chemical components of Zhengyuan Prescription were analyzed, network pharmacology study and animal experiment verification was conducted.The main chemical components of Zhengyuan Prescription was detected by UPLC-TOF/MS technology, the action targets of main chemical components and the targets of leukopenia were searched through the databases. Then the Venn diagram was used to get the intersection targets. The protein-protein interaction network of intersection targets and “herb-ingredient-target” network map were constructed by Cytoscape 3.7.2 software, meanwhile, the key components and targets with high degrees were screened out. R software was used to perform gene ontology function enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes enrichment analysis. The healthy male SD rats were divided into the blank control group, model control group, positive drug group 0.11 g/(kg?d) (Diyu Shengbai Tablets), Zhengyuan Prescription high-dose [2.73 g/(kg?d)] medium- dose [1.37 g/(kg?d)], and low-dose [0.68 g/(kg?d)] groups. Cyclophosphamide [40 mg/(kg?d)] was given by intraperitoneal injection for 4 d to induce leukopenia rat model. The number of white blood cell was counted, and organ index was detected. Tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-6 (IL-6) contents were detected with ELISA kit.Twenty-four main chemical components of Zhengyuan Prescription were obtained by UPLC-TOF/MS technology. Network pharmacology results showed that there were many active components in Zhengyuan Prescription, which acted on 377 targets, 1952 disease-related targets were retrieved, and 124 targets were intersected. The core components were screened such as ginsenoside Rg1, ferulic acid, ginsenoside Rb1ginsenoside Rg2, ginsenoside Ro, kaempferol; The key targets were screened such as IL-6 and TNF, the important pathways including IL-17 signaling pathway and so on. The animal experiments results showed that: Compared with the model group, the high and medium doses of Zhengyuan Prescription administration groups significantly increased the number of white blood cell and thymus index of rats, significantly reduced the elevated TNF-α and IL-6 levels in the serum (< 0.05), and it can reduce the pathological damage of spleen and thymus tissues in rats with leukopenia.The material basis of Zhengyuan Prescription for treating leukopenia is based on ginsenoside-based chemical components, and the related mechanism of action has the characteristics of multiple targets and multiple pathways.

Zhengyuan Prescription; cyclophosphamide; bone marrow suppression; leukopenia;L.; network pharmacology

R283.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6586 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.017

2021-05-14

國家重大科技專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目（2019ZX09301-133）；陜西省科技廳重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈（群）項(xiàng)目（2020ZDLSF05-08）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-21）

張君威（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹?。Tel: 15709101017 E-mail: 2982429741@qq.com

唐志書（1972—），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥資源開發(fā)與中藥質(zhì)量分析研究。Tel: (029)38185060 E-mail: tzs6565@163.com

劉妍如（1985—），副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制研究。Tel: (029)38182201 E-mail: yanzi_2203@aliyun.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]