許金國，梅 茜，夏金鑫，趙曉莉，謝 輝，毛 靖，高紅寧，李 鵬，陸兔林*，毛春芹*

經(jīng)典名方當(dāng)歸四逆湯物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析

許金國1，梅 茜1，夏金鑫1，趙曉莉1，謝 輝1，毛 靖1，高紅寧1，李 鵬2，陸兔林1*，毛春芹1*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司，江蘇 南京 210023

建立經(jīng)典名方當(dāng)歸四逆湯物質(zhì)基準(zhǔn)的HPLC特征圖譜及指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法，闡明當(dāng)歸四逆湯物質(zhì)基準(zhǔn)關(guān)鍵質(zhì)量屬性，為后續(xù)復(fù)方制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。制備18批當(dāng)歸四逆湯物質(zhì)基準(zhǔn)，建立HPLC特征圖譜，進(jìn)行特征峰歸屬及相似度評(píng)價(jià)；測(cè)定指標(biāo)性成分的含量，對(duì)物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行量值傳遞分析。18批物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜的相似度均大于0.90，共確定19個(gè)特征峰，分別來自方中當(dāng)歸（峰4、5、19）、桂枝（峰10、11、14）、白芍（峰6、9）、細(xì)辛（峰1、3、13、15、18）和炒甘草（峰7、8、12、16、17）；各指標(biāo)成分從飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)的轉(zhuǎn)移率分別為芍藥苷78.47%～96.01%、甘草苷43.79%～94.62%、阿魏酸81.20%～131.24%、肉桂酸70.03%～106.75%、桂皮醛3.17%～5.50%、甘草酸31.08%～52.43%、細(xì)辛脂素9.63%～13.37%。采用特征圖譜結(jié)合多指標(biāo)性成分含量測(cè)定對(duì)當(dāng)歸四逆湯物質(zhì)基準(zhǔn)進(jìn)行量值傳遞研究，該方法科學(xué)合理，為當(dāng)歸四逆湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制及復(fù)方制劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

經(jīng)典名方；當(dāng)歸四逆湯；物質(zhì)基準(zhǔn)；量值傳遞；當(dāng)歸；桂枝；白芍；細(xì)辛；炒甘草；芍藥苷；甘草苷；阿魏酸；肉桂酸；桂皮醛；甘草酸；細(xì)辛脂素；質(zhì)量控制

當(dāng)歸四逆湯（Danggui Sini Decoction，DSD）來源于漢代張仲景所著《傷寒論》，由當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、炒甘草［經(jīng)考證確定原方中的甘草（炙）為炒甘草，炒甘草與炙甘草炮制方法不同，本研究中為炒甘草，非炙甘草］、木通、大棗7味藥組成，具有溫運(yùn)血行、散寒通脈的功效，主治血脈凝澀、手足厥寒；或腸鳴腹痛、下利不止等病癥[1-2]。方中當(dāng)歸甘溫，主入肝經(jīng)，養(yǎng)血和血以補(bǔ)虛；桂枝辛溫，溫經(jīng)散寒以通脈，共為君藥。細(xì)辛溫經(jīng)散寒，增桂枝溫通之力；白芍養(yǎng)血和營，既助當(dāng)歸補(bǔ)益營血，又配桂枝以和陰陽，共為臣藥。木通通利經(jīng)脈以暢血行；大棗、甘草，益氣健脾、養(yǎng)血補(bǔ)虛，皆為佐藥。重用大棗，既合歸、芍以補(bǔ)營血，又防桂枝、細(xì)辛燥烈太過，傷及陰血。甘草兼調(diào)藥而為使藥之用。全文共奏溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈之功[3]。該方組方配伍精良，臨床療效優(yōu)異，被歷代醫(yī)家所推崇，廣泛用于臨床數(shù)百年，現(xiàn)代臨床用于糖尿病周圍神經(jīng)病變[4]、雷諾綜合征[5]、痛經(jīng)[6]等疾病的治療。該方位于國家中醫(yī)藥管理局2018年發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[7]，作為經(jīng)典名方開發(fā)研究的主要對(duì)象之一。在其研究過程中，制備多批次物質(zhì)基準(zhǔn)，全面考察藥材-飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)的相關(guān)性，關(guān)注物質(zhì)基準(zhǔn)制備過程中關(guān)鍵質(zhì)量屬性的量值傳遞，對(duì)于保證經(jīng)典名方的臨床療效，制備經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑具有重要意義。

物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量研究是經(jīng)典名方開發(fā)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，關(guān)鍵質(zhì)量屬性的量值傳遞研究能為全面控制經(jīng)典名方質(zhì)量提供依據(jù)。本研究在確定煎煮工藝的基礎(chǔ)上，通過隨機(jī)數(shù)表法組合制備18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)，對(duì)其特征圖譜、指標(biāo)性成分含量進(jìn)行測(cè)定，分析飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)關(guān)鍵質(zhì)量屬性量值傳遞規(guī)律，初步確定DSD物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)性成分含量及轉(zhuǎn)移率的質(zhì)量控制范圍，為經(jīng)典名方DSD復(fù)方制劑的開發(fā)研究和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MS-105DU型電子分析天平，梅特勒-托利多公司，＝0.01 mg；KQ-500E數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Intergral水純化系統(tǒng)，美國Millipore公司；H1650-W型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；AE-1106A型愛仕卡微電腦電陶爐，中山市愛米生活電器有限公司；Waters e2695高效液相色譜儀，包括Empower工作站，自動(dòng)進(jìn)樣器，2998檢測(cè)器，美國Waters公司。

1.2 試藥

當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、炒甘草、木通、大棗飲片具體信息見表1，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，分別為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels.的干燥根、樟科樟屬植物肉桂Presl.的干燥嫩枝、毛莨科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根、馬兜鈴科細(xì)辛屬植物北細(xì)辛Fr. Schmidt var.(Maxim.) Kitag.的干燥根和根莖、豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖、木通科木通屬植物三葉木通(Thunb.) Koidz.的干燥藤莖、鼠李科棗屬植物棗Mill.的干燥成熟果實(shí)。當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、木通、大棗均按照《中國藥典》2020年版炮制成符合要求的飲片，炒甘草按照《中國藥典》2020年版及《浙江省中藥飲片炮制規(guī)范（2015年版）》指導(dǎo)下優(yōu)化工藝參數(shù)炮制所得。

對(duì)照品阿魏酸（批號(hào)110773-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%）、桂皮醛（批號(hào)110710-201217，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、肉桂酸（批號(hào)110786-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）、芍藥苷（批號(hào)110736-201943，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.1%）、細(xì)辛脂素（批號(hào)111889-201705，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%）、甘草苷（批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-202021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）、苯甲酸（批號(hào)100419-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品藁本內(nèi)酯（批號(hào)200626，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自南京森貝伽生物科技有限公司。

乙腈，色譜純，默克股份有限公司；甲醇，色譜純，江蘇漢邦科技有限公司；磷酸，色譜純，上海阿拉丁生化科技有限公司；其他試劑為分析純。

表1 DSD飲片來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)的制備

通過劑量考證確定處方中各飲片所用劑量，根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求（征求意見稿）》（以下簡稱《申報(bào)資料》），對(duì)浸泡時(shí)間、煎煮火力、是否加蓋3個(gè)因素進(jìn)行考察，最終確定煎煮工藝。

采用隨機(jī)數(shù)表法，對(duì)不同批號(hào)的當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、炒甘草、木通及大棗7味飲片進(jìn)行隨機(jī)組合，形成18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)的處方。分別稱取當(dāng)歸9 g，桂枝9 g，白芍9 g，細(xì)辛9 g，木通6 g，炒甘草6 g，大棗24 g置砂鍋中，加水1600 mL，浸泡45 min，武火（2200 W）煮沸后轉(zhuǎn)文火（1000 W）煎煮約70 min，煮至約600 mL，100目篩濾過，調(diào)整體積至600 mL，共制得18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)，編號(hào)為DSD01～DSD18。分別取處方量單味飲片，同法制備，即得各單味飲片水煎液。

2.2 DSD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 Merck Purospher Star LP RP-18Endcapped色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～20 min，2%～15%乙腈；20～30 min，15%～20%乙腈；30～38 min，20%～25%乙腈；38～50 min，25%～40%乙腈；50～55 min，40%～50%乙腈；55～65 min，50%～95%乙腈；65～68 min，95%～2%乙腈；體積流量0.9 mL/min；檢測(cè)波長220 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取DSD物質(zhì)基準(zhǔn)3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇6 mL，再加水至刻度，使甲醇體積分?jǐn)?shù)為60%，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液離心10 min（12 000 r/min），即得。

各單味飲片供試品溶液制備方法同物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為DSD15的DSD物質(zhì)基準(zhǔn)制備的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。以芍藥苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.20%，相對(duì)峰面積RSD＜4.31%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為DSD15的DSD物質(zhì)基準(zhǔn)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣檢測(cè)。以芍藥苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.17%，相對(duì)峰面積RSD＜4.54%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為DSD15的DSD物質(zhì)基準(zhǔn)制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測(cè)。以芍藥苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.18%，相對(duì)峰面積RSD＜4.50%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 18批DSD特征圖譜的測(cè)定及相似度分析 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備18批供試品溶液，采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。將18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜以AIA格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，對(duì)前4 min的色譜峰進(jìn)行剪切，以S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1，采用中位數(shù)法，進(jìn)行全譜峰匹配，計(jì)算相似度。

DSD物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)照特征圖譜見圖1，18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜疊加圖見圖2，相似度見表2。18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜與對(duì)照特征圖譜的相似度大于0.90。

2.3 飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜的量值傳遞關(guān)系研究

將18批物質(zhì)基準(zhǔn)生成的對(duì)照?qǐng)D譜與各味飲片（當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、炒甘草）的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖3，并以每味中藥中的1個(gè)特征峰為參考峰，計(jì)算相對(duì)峰面積，比較物質(zhì)基準(zhǔn)和各飲片中特征峰峰面積的比值，結(jié)果見表3。DSD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜標(biāo)定了19個(gè)色譜峰，對(duì)其中18個(gè)特征峰進(jìn)行了單味飲片的歸屬研究，并經(jīng)與對(duì)照品色譜峰比對(duì)，同時(shí)結(jié)合PAD光譜，指認(rèn)出8個(gè)特征峰信息。其中1、3、13、15、18（細(xì)辛脂素）號(hào)峰來源于細(xì)辛；6（芍藥苷）、9（苯甲酸）號(hào)峰來源于白芍；4、5、19（藁本內(nèi)酯）號(hào)峰來源于當(dāng)歸；7、8、12（甘草酸），16、17號(hào)峰來源于甘草；10（肉桂酸）、11（桂皮醛）、14號(hào)峰來源于桂枝。2號(hào)峰沒有找到歸屬，但在前期研究中在白芍單煎中指認(rèn)到該成分[8]，而在此次研究中沒有指認(rèn)到該色譜峰，推測(cè)原因可能是由于加水量與生藥量的倍比關(guān)系不同，造成成分溶出率出現(xiàn)較大差異。

2-沒食子酸 6-芍藥苷 9-苯甲酸 10-肉桂酸 11-桂皮醛 12-甘草酸 18-細(xì)辛脂素 19-藁本內(nèi)酯

圖2 18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜

表2 18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜相似度

圖3 各味藥飲片對(duì)照?qǐng)D譜與物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D譜對(duì)比

表3 DSD物質(zhì)基準(zhǔn)與各藥味飲片中特征峰峰面積比值

從單味藥相對(duì)峰面積與全方物質(zhì)基準(zhǔn)相對(duì)峰面積的差異的比值可以看出，大部分特征峰的比值在各飲片和物質(zhì)基準(zhǔn)中變化較小，各飲片中特征峰與物質(zhì)基準(zhǔn)中對(duì)應(yīng)特征峰峰面積雖存在差異，但各飲片大部分相對(duì)峰面積與物質(zhì)基準(zhǔn)中相對(duì)峰面積相似，表明飲片單煎和多味飲片合煎時(shí)不同成分含量間比例關(guān)系較為穩(wěn)定，各藥味中的主要物質(zhì)群可較為完整地從飲片傳遞到物質(zhì)基準(zhǔn)中，且物質(zhì)群歸屬清晰。

個(gè)別特征峰的比值在飲片和物質(zhì)基準(zhǔn)間存在明顯差異，如以芍藥苷（6號(hào)峰）為參照峰時(shí)的苯甲酸（9號(hào)峰）、以4號(hào)峰為參照峰時(shí)的5號(hào)峰、以1號(hào)峰為參照峰時(shí)的細(xì)辛脂素（18號(hào)峰），推測(cè)可能與復(fù)方中的多成分化合物在煎煮過程中發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。

2.4 18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)性成分含量測(cè)定及量值傳遞關(guān)系研究

2.4.1 色譜條件 Merck Purospher Star LP RP-18Endcapped色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～14 min，16%～19%乙腈；14～20 min，19%～25%乙腈；20～30 min，25%～35%乙腈；30～40 min，35%～50%乙腈；40～50 min，50%乙腈；50～62 min，50%～65%乙腈；62～63 min，65%～16%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長230、250、287、316 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.4.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸、細(xì)辛脂素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為390.72、70.44、9.79、8.88、20.40、135.60、7.04 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取不同質(zhì)量濃度的指標(biāo)性成分對(duì)照品溶液，采用“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸和細(xì)辛脂素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 DSD物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)性成分線性關(guān)系和加樣回收率考察結(jié)果

2.4.5 精密度考察 取同一批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)（DSD01），參照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸和細(xì)辛脂素峰面積的RSD值分別為0.13%、0.21%、0.63%、0.24%、0.31%、0.23%、0.76%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性考察 取同一批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)（DSD01）6份，參照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸和細(xì)辛脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為2.20%、1.50%、1.90%、1.50%、0.97%、2.00%、2.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 取同一批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)（DSD01），參照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在制樣后0、2、4、8、12、18、24 h進(jìn)行測(cè)定，芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸和細(xì)辛脂素峰面積的RSD分別為0.09%、0.19%、1.20%、0.19%、0.71%、0.17%、1.50%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率考察 精密量取已測(cè)知指標(biāo)成分含量的DSD物質(zhì)基準(zhǔn)（DSD01）3 mL，共6份，分別加入一定量的對(duì)照品，采用“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定樣品中各指標(biāo)成分含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表5所示，芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸和細(xì)辛脂素的加樣回收率均在95%～105%，RSD值均小于3.0%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.9 樣品測(cè)定及量值傳遞關(guān)系研究 飲片中指標(biāo)性成分的含量，按《中國藥典》2020年版測(cè)定，飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率按公式計(jì)算，結(jié)果見表5。由表5結(jié)果可知，18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)性成分芍藥苷為2.04%～2.75%，平均轉(zhuǎn)移率為85.15%；阿魏酸為0.057%～0.073%，平均轉(zhuǎn)移率為110.74%；細(xì)辛脂素為0.030%～0.048%，平均轉(zhuǎn)移率為11.08%。根據(jù)相關(guān)規(guī)定，不同批次物質(zhì)基準(zhǔn)的指標(biāo)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及轉(zhuǎn)移率應(yīng)控制在其均值的70%～130%，本研究中18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)中芍藥苷、阿魏酸、細(xì)辛脂素含量及轉(zhuǎn)移率均在均值70%～130%，從芍藥苷、阿魏酸、細(xì)辛脂素的轉(zhuǎn)移率進(jìn)行分析，DSD物質(zhì)基準(zhǔn)的制備工藝穩(wěn)定，不同批次物質(zhì)基準(zhǔn)的芍藥苷、阿魏酸、細(xì)辛脂素轉(zhuǎn)移率符合要求，說明實(shí)驗(yàn)前期當(dāng)歸、白芍、細(xì)辛的質(zhì)量控制及物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝可以實(shí)現(xiàn)DSD中芍藥苷、阿魏酸、細(xì)辛脂素含量的穩(wěn)定傳遞。

轉(zhuǎn)移率＝/

表示物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)性成分的含量，表示飲片中指標(biāo)性成分的含量

DSD物質(zhì)基準(zhǔn)中肉桂酸為0.022%～0.054%，平均轉(zhuǎn)移率為89.28%；桂皮醛為0.055%～0.105%，平均轉(zhuǎn)移率為4.12%；甘草苷為0.42%～0.85%，平均轉(zhuǎn)移率為65.37%；甘草酸為0.95%～1.65%，平均轉(zhuǎn)移率為41.15%。部分批次物質(zhì)基準(zhǔn)中甘草苷、甘草酸、肉桂酸、桂皮醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)未在其均值的70%～130%，甘草苷和桂皮醛轉(zhuǎn)移率未在均值的70%～130%。研究表明，甘草不同組織部位（木質(zhì)部、韌皮部和木栓層）中總黃酮含量及甘草苷含量存在顯著性差異，是造成不同批次甘草中指標(biāo)性成分含量差異較大的主要原因[9]，本研究中甘草的研究結(jié)果與多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果相一致[10-11]。物質(zhì)基準(zhǔn)中，肉桂酸和桂皮醛在其均值70%～130%外的批次，其所對(duì)應(yīng)批次飲片中的肉桂酸和桂皮醛也在其均值70%～130%外，這提示在今后進(jìn)行DSD物質(zhì)基準(zhǔn)制備時(shí)，首先要制定飲片原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍，且對(duì)飲片藥用部位及大小嚴(yán)格分檔，保證原料質(zhì)量的均一、穩(wěn)定，以確保物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量的穩(wěn)定。

表5 DSD物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率

3 討論

3.1 物質(zhì)基準(zhǔn)處方組成、劑量及制備方法

《傷寒論》中DSD原方記載為：“當(dāng)歸三兩，桂枝三兩（去皮），芍藥三兩，細(xì)辛三兩，甘草二兩（炙），通草二兩，大棗二十五枚（擘）。上七味，以水八升，煮取三升，去滓”，經(jīng)文獻(xiàn)考證[12-14]，確定方中芍藥為現(xiàn)今白芍，通草為木通，甘草（炙）為炒甘草，1兩為3 g，1升折合200 mL，大棗25枚折合為24 g。根據(jù)《申報(bào)資料》要求，收集不少于3個(gè)產(chǎn)地（包含道地藥材產(chǎn)地、主產(chǎn)區(qū)）不少于15批次的藥材進(jìn)行質(zhì)量分析，確定藥材的最佳產(chǎn)地，并炮制為對(duì)應(yīng)飲片。隨后對(duì)煎煮、濾過、濃縮及干燥工藝進(jìn)行了研究，最終確定DSD物質(zhì)基準(zhǔn)制備方法。

3.2 DSD物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液制備方法考察

本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)供試品制備的超聲提取法的主要影響因素提取溶劑（水、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇），提取時(shí)間（15、30、45 min），提取功率（250、350、500 W）進(jìn)行了全面考察，以7個(gè)指標(biāo)性成分提取率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終選擇供試品溶液的制備方法為以60%甲醇為溶劑，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）30 min。

3.3 色譜條件考察

實(shí)驗(yàn)前期比較了不同廠家（Waters、Merck、Hanbon）生產(chǎn)的色譜柱分離效果，對(duì)不同流動(dòng)相（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液），不同柱溫（25、30、35 ℃）、不同體積流量（0.8、0.9、1.0、1.2 mL/min）等進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以Merck色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，柱溫25 ℃（特征圖譜）、30 ℃（含量測(cè)定），體積流量為0.9 mL/min（特征圖譜）、1.0 mL/min（含量測(cè)定）時(shí)，有較好的色譜峰峰形，分離度良好，出峰數(shù)量較多，響應(yīng)值較高，因此確定為色譜條件。

采用紫外檢測(cè)器對(duì)DSD物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，分析其3D圖譜，特征圖譜研究中比較了220、245、280 nm波長下的色譜圖，綜合考慮其出峰數(shù)量、峰形、基線等情況，最終選定220 nm最為特征圖譜的檢測(cè)波長。多成分含量測(cè)定研究中通過全波長掃描結(jié)合各指標(biāo)性成分最大紫外吸收波長，最終確定采用多波長切換法，在230 nm下測(cè)定芍藥苷和甘草苷，250 nm下測(cè)定甘草酸，287 nm下測(cè)定肉桂酸、桂皮醛和細(xì)辛脂素，在316 nm下測(cè)定阿魏酸。

3.4 飲片與物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜傳遞

全方標(biāo)定的特征峰，能歸屬到當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛和炒甘草5味飲片，而木通和大棗在該色譜條件下色譜峰信息少、響應(yīng)值較低，在全方特征圖譜中未見有特征峰的體現(xiàn)。木通和大棗均為方中的佐藥，木通主要的活性成分包括三萜及三萜皂苷類、酚醇及其苷類等，其中，三萜皂苷類化合物的苷元類型有10種，以常春藤皂苷元、齊墩果酸皂苷元較為常見[15]；大棗中的化學(xué)成分復(fù)雜，含有環(huán)磷腺苷、鳥苷、蘆丁、槲皮素和葡萄糖等化學(xué)成分[16]。木通和大棗中的成分在本實(shí)驗(yàn)條件下可能由于成分含量低、響應(yīng)值低、梯度洗脫程序不適宜等因素導(dǎo)致出峰不明顯，無法體現(xiàn)藥味信息。在后期實(shí)驗(yàn)中可單獨(dú)建立復(fù)方中木通和大棗特征圖譜測(cè)定方法，同時(shí)結(jié)合薄層色譜鑒別、大類成分含量測(cè)定等方法，對(duì)DSD全方進(jìn)行整體的質(zhì)量控制。

3.5 飲片與物質(zhì)基準(zhǔn)的指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率分析

DSD主要用于治療血虛寒厥證，方中與此主治病癥相關(guān)的藥效成分為阿魏酸、桂皮醛、肉桂酸、芍藥苷、甘草苷和甘草酸[17]，細(xì)辛脂素為歷版《中國藥典》中細(xì)辛的質(zhì)控成分，具有抗病毒、抗結(jié)核桿菌的作用[18]，故選擇上述7個(gè)成分含量為指標(biāo)進(jìn)行DSD物質(zhì)基準(zhǔn)含量的研究。指標(biāo)性成分含量及轉(zhuǎn)移率結(jié)果中，桂皮醛和細(xì)辛脂素的轉(zhuǎn)移率較低。桂皮醛為熱不穩(wěn)定性成分，在制備DSD物質(zhì)基準(zhǔn)的過程中采用加熱煎煮的方式制備，溫度高且煎煮時(shí)間較長，故造成桂皮醛由飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)的轉(zhuǎn)移率較低；細(xì)辛脂素為木脂素類成分，是歷版《中國藥典》中細(xì)辛鑒別和含量測(cè)定的指標(biāo)性成分[19]，游離木脂素為脂溶性成分，一般難溶于水，本研究采用的提取方式為水煎煮，故細(xì)辛脂素的提取效率較低。轉(zhuǎn)移率低表明從飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)傳遞的過程中含量損失較高，這也提示在后續(xù)制劑開發(fā)的過程中需注意溫度和加熱時(shí)間對(duì)熱不穩(wěn)定成分的影響。

4 結(jié)論

物質(zhì)基準(zhǔn)是經(jīng)典名方制劑研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是衡量復(fù)方制劑與傳統(tǒng)湯劑是否一致的標(biāo)準(zhǔn)[20-22]。物質(zhì)基準(zhǔn)同中藥配方顆粒中標(biāo)準(zhǔn)湯劑一樣，為中藥藥用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，其標(biāo)準(zhǔn)主要涵蓋了投料中藥飲片的道地性、制備工藝的統(tǒng)一性，以及質(zhì)量控制的嚴(yán)謹(jǐn)性[23]。本研究選用來自道地產(chǎn)地或主產(chǎn)區(qū)的原料進(jìn)行投料，采用統(tǒng)一的制備方法制備了18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)開展研究，18批DSD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜相似度較高，指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率大部分在均值±30%范圍內(nèi)，表明制備工藝穩(wěn)定可行。所建立的DSD物質(zhì)基準(zhǔn)的HPLC特征圖譜及多指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法，能實(shí)現(xiàn)對(duì)方中君藥當(dāng)歸和桂枝，臣藥白芍和細(xì)辛，佐使藥炒甘草的化學(xué)表征，可為DSD復(fù)方制劑的進(jìn)一步開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 南京中醫(yī)學(xué)院傷寒教研組. 傷寒論譯釋 [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1980: 1195-1196.

[2] 李克紹. 傷寒論語釋 [M]. 濟(jì)南: 山東科學(xué)技術(shù)出版社, 1982: 294.

[3] 李冀, 連建偉. 方劑學(xué) [M]. 第4版. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2016: 111.

[4] 萬首燕, 王宏麗. 當(dāng)歸四逆湯結(jié)合a-硫辛酸治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的療效 [J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2020, 39(2): 12-13.

[5] 單梅花. 當(dāng)歸四逆湯加味治療雷諾綜合征臨床分析 [J]. 河南醫(yī)學(xué)研究, 2017, 26(7): 1282-1283.

[6] 周少澎. 當(dāng)歸四逆湯配合艾灸對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)的療效與安全性評(píng)價(jià) [J]. 中國處方藥, 2019, 17(4): 98-99.

[7] 國家中醫(yī)藥管理局. 關(guān)于發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》[EB/OL]. [2018-04-13]. http://kjs.satcm.gov.cn/ zhengcewenjian/2018-04-16/7107.html.

[8] 梅茜, 夏金鑫, 郭爽, 等. 基于指紋圖譜及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的白芍質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(10): 2627-2633.

[9] 王漢卿, 雍婧姣, 肖東, 等. 寧夏產(chǎn)甘草不同組織部位成分差異比較 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2019, 34(6): 2672-2675.

[10] 劉冬涵, 薛宇濤, 羅菊元, 等. 經(jīng)典名方苓桂術(shù)甘湯的物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析 [J]. 中國中藥雜志, 2019, 44(24): 5421-5428.

[11] 王璐, 謝輝, 趙曉莉, 等. 經(jīng)典名方“竹茹湯”的物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析[J/OL]. 中國中藥雜志, [2021-06-14]. https://doi.org/10.19540/j.cnki.cjcmm. 20210302.304.

[12] 黃英杰. 《傷寒論》用藥劑量及其相關(guān)問題的研究 [D].北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2007.

[13] 李培生, 劉渡舟. 傷寒論講義 [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1985: 228.

[14] 廣州中醫(yī)學(xué)院. 方劑學(xué) [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1979: 12.

[15] 柳岳超, 李洪亮, 曾小華, 等. 三葉木通藤莖的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 34(3): 99-106.

[16] 曾杉, 甘偉發(fā), 史紫娟. 不同產(chǎn)地的大棗藥材UPLC指紋圖譜及含量測(cè)定方法研究 [J]. 廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 36(4): 458-462.

[17] 彭霞. 當(dāng)歸四逆湯方證研究 [D]. 廣州: 暨南大學(xué), 2013.

[18] 赫一鳴. 北細(xì)辛及其飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)研究 [D]. 長春: 長春中醫(yī)藥大學(xué), 2020.

[19] 吳昊, 溫曉茵, 顏鵬, 等. 細(xì)辛的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2021, 27(4): 186-195.

[20] 關(guān)雅戈, 羅贛, 高曉燕, 等. 經(jīng)典名方桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)關(guān)鍵質(zhì)量屬性研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(8): 2267-2275.

[21] 葛威, 劉小康, 王康宇, 等. 經(jīng)典名方竹葉石膏湯的物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞分析 [J]. 中草藥, 2021, 52(11): 3239-3248.

[22] 張欣舒, 董金香, 楊凈堯, 等. 經(jīng)典名方保元湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜及多指標(biāo)量值傳遞研究 [J]. 藥物分析雜志, 2021, 41(2): 345-358.

[23] 國家藥品監(jiān)督管理局. 關(guān)于發(fā)布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》的通告（2021年第16號(hào)）[EB/OL]. [2021-01-26]. https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ ggtg/qtggtg/20210210145453181.html.

Analysis on quality value transmitting of substance benchmarks of Danggui Sini Decoction

XU Jin-guo1, MEI Xi1, XIA Jin-xin1, ZHAO Xiao-li1, XIE Hui1, MAO Jing1, GAO Hong-ning1, LI Peng2, LU Tu-lin1, MAO Chun-qin1

1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Nanjing Hailing Pharmaceutical Technology Research Co., Ltd., Nanjing 210023, China

To establish the HPLC characteristic chromatogram and multi-index components determination for substance benchmark of Danggui Sini Decoction (DSD, 當(dāng)歸四逆湯), which clarified the critical quality attributes, so as to lay a foundation for subsequent formulation development.The substance benchmark of 18 batches of DSD was prepared based on ancient medical records. The characteristic chromatogram methodology was established to evaluate the origin and similarity of characteristic peaks, the components content and transfer rate were measured and the transfer analysis of substance benchmark was performed.The similarity of the 18 bathes of DSD material characteristic chromatogram were all greater than 0.90, and a total of 19 characteristic peaks were identified, which came from Danggui () (peaks 4, 5, 19), Guizhi ()(peaks 10, 11, 14), Baishao () (peaks 6, 9), Xixin (et) (peaks 1, 3, 13, 15, and 18) and Chaogancao (friedet) (peaks 7, 8, 12, 16, and 17). The transfer rate of each index component from the decoction pieces to the substance benchmark was in the range of paeoniflorin 78.47%—96.01%, liquiritin 43.79%—94.62%, ferulic acid 81.20%—131.24%, cinnamic acid 70.03%—106.75%, cinnamaldehyde 3.17%—5.50%, glycyrrhizic acid 31.08%—52.43%; asarone 9.63%—13.37%.In this study, the HPLC characteristic chromatogram combined with multi-index components determination were used to carry out the quantity value transfer analysis of the substance benchmark of DSD. The method is scientific and reasonable, and can provide scientific basis for the quality control substance benchmark and the development of compound preparations of DSD.

classical prescriptions; Danggui Sini Decoction; substance benchmarks; quality value transmitting;;;;et; friedet; paeoniflorin; glycyrrhizin;ferulic acid; cinnamic acid; cinnamaldehyde;glycyrrhizic acid; asarone; quality control

R283.6

A

0253 - 2670(2021)21 - 6501 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.007

2021-04-29

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707000）

許金國，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: 300024@njucm.edu.cn

陸兔林，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: ltl2021@njucm.edu.cn

毛春芹，正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥新藥研發(fā)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: 300555@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]