陳 晗，張 爭(zhēng)，陳向東，王 勇，王琦宏 ，曾念開(kāi)▲

(1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2教育部熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199；3白沙天瑞達(dá)實(shí)業(yè)有限公司，海南 白沙 572800)

赤芝GanodermalingzhiSheng H.Wu，Y.Cao & Y.C.Dai在分類上隸屬于多孔菌目Polyporales靈芝科Ganodermataceae[1]，是一種傳統(tǒng)的藥用真菌，具有補(bǔ)氣安神，止咳平喘的功效，用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，靈芝具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、保肝護(hù)肝等多種作用[3]。靈芝含有400多種生物活性化合物，包括多糖、三萜、核苷酸、甾體、甾醇、脂肪酸和多肽等[4]。靈芝多糖多提取于靈芝的子實(shí)體、菌絲體、孢子中，是靈芝的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、 降血糖、神經(jīng)保護(hù)、抗衰老、抗疲勞、抗炎等功能特性[4]。靈芝所含有的靈芝酸，為植物所沒(méi)有，各種靈芝中分離得到的靈芝酸已達(dá)100多種[4]。靈芝酸為保護(hù)肝功能的主要成分，具有護(hù)肝、解毒和止痛等藥理活性[4]。如靈芝酸H和靈芝酸A能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖[4，5]，靈芝酸B，A和C能抑制人白血病細(xì)胞HL-60的生長(zhǎng)[4，6]。

海南地處熱帶，分布有赤芝等眾多的靈芝科真菌[1]。但近年來(lái)，由于人們?cè)诤Ｄ蠈?duì)野生靈芝科真菌進(jìn)行過(guò)度采集，包括赤芝在內(nèi)的野生靈芝逐年減少[7]。因此在保護(hù)野生靈芝種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，對(duì)赤芝等進(jìn)行人工栽培已經(jīng)成了當(dāng)務(wù)之急。同時(shí)，為了滿足人們追求綠色健康產(chǎn)品的需求，進(jìn)行仿野生栽培已經(jīng)成了一種重要的栽培方式。在海南，人工栽培的橡膠樹(shù)Heveabrasiliensis(Willd.ex A.Juss.)Muell.Arg.占據(jù)了海南很大的面積，具有大量的林下空間。為了充分利用橡膠樹(shù)林下的閑置空間，我們進(jìn)行了橡膠樹(shù)林下赤芝的栽培。此外，我們?cè)谙鹉z樹(shù)林下采用不同的栽培方式，并檢測(cè)不同栽培模式下赤芝子實(shí)體多糖和靈芝酸的含量，為橡膠-赤芝復(fù)合栽培模式的構(gòu)建提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 栽培場(chǎng)地

海南省白沙縣元門鄉(xiāng)紅茂村委會(huì)方什村人工栽培橡膠樹(shù)林下；安徽省霍山縣野生闊葉林下。

2 赤芝栽培方法

以栓皮櫟QuercusvariabilisBlume的莖為菌材，采用段木栽培方法，具體方法和步驟參見(jiàn)蘭進(jìn)等[8]。

3 材料與方法

3.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要試劑與儀器

3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

赤芝菌種“瓊2號(hào)”為海南野生赤芝子實(shí)體分離獲得；測(cè)量多糖和靈芝酸的赤芝子實(shí)體為海南橡膠林下仿野生栽培、成熟狀態(tài)的子實(shí)體，同時(shí)以安徽省霍山縣闊葉林下、采用埋土方式、仿野生栽培的成熟子實(shí)體為對(duì)照。憑證標(biāo)本保存于海南醫(yī)學(xué)院真菌標(biāo)本館(FHMU)。

3.1.2 主要試劑

硫酸(分析純)、蒽酮(分析純)、乙醇(分析純)、磷酸(分析純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，無(wú)水葡萄糖、靈芝酸等對(duì)照品購(gòu)自成都普斯生物科技有限公司。

3.1.3 主要儀器

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，AL104精密電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，DHG-9076A電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠)，KQ-100V型超聲波清洗器(上海錦玟儀器設(shè)備有限公司)，TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)，KDC-4 低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)，LC-2030高效液相色譜儀(日本島津公司)。

3.2 紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定赤芝多糖的含量

3.2.1 赤芝多糖的提取

取赤芝子實(shí)體粉末1.0 g，精確稱定，于100 mL具塞錐形瓶中加入20 mL蒸餾水，超聲30 min。抽濾樣品，用5 mL蒸餾水沖洗瓶中殘余藥渣及濾紙，總濾液約25 mL于蒸發(fā)皿中水浴80 ℃蒸干/烘箱100 ℃烘干。向蒸發(fā)皿中殘余物加4 mL蒸餾水，將粗多糖溶解移至50 mL離心管中，再加入1 mL蒸餾水繼續(xù)溶解轉(zhuǎn)移粗多糖，共得到5 mL多糖溶液。向50 mL離心管中加入乙醇至47.5 mL，4 ℃靜置12 h以上，5000 rpm 離心15 min后棄上清液，將離心管開(kāi)蓋水浴蒸干得到赤芝粗多糖樣品。

3.2.2 赤芝多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制120 μg/mL的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，精密量取對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液(精密量取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使之溶解，搖勻)6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立刻冰浴15 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為Y=0.0012X-0.0013，R2=0.9993，線性范圍0.00～735 μg/mL。

3.2.3 赤芝粗多糖供試品溶液的制備

向裝有赤芝粗多糖的離心管中加入5 mL蒸餾水，超聲5 min使其溶解，將溶液連同沉淀物轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，充分搖勻使沉淀物分散，離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的10 mL離心管，得到多糖溶液，-20 ℃保存。取1 mL多糖溶液，定容于10 mL容量瓶作為供試品溶液。

3.2.4 赤芝多糖的含量測(cè)定

用移液槍取供試品溶液1 mL于具塞試管中，加入1 mL蒸餾水，使用10 mL移液管迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液，立刻搖勻，放置15 min后立刻置于冰浴中冷卻15 min，取出，以2 mL蒸餾水加6 mL硫酸蒽酮溶液為空白，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

3.3 HPLC法測(cè)定赤芝中靈芝酸的含量

3.3.1 供試品溶液的制備

取干燥的赤芝子實(shí)體粉末2.0 g，精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，用移液管準(zhǔn)確加入40 mL乙醇，超聲20 min后搖勻抽濾，收集濾液，藥渣再次加40 mL乙醇超聲20 min，收集合并兩次濾液，將濾液38 ℃真空干燥，用色譜甲醇定容至5 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液即得。

3.3.2 靈芝酸含量測(cè)定的色譜條件

測(cè)定波長(zhǎng)：257 nm；色譜柱：安捷倫Angilant PromosilC18(2.1 mm× 15 cm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedures

3.3.3 靈芝酸A 的含量測(cè)定線性方程

分別取靈芝酸A溶液(1.0 mg/mL)200 μL、300 μL、400 μL、500 μL于1 mL容量瓶中，用甲醇(HPLC級(jí))定容至刻度得0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL靈芝酸A溶液，分別HPLC進(jìn)樣5 μL，制作靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=14299X-7543.3，R2=0.9961，線性范圍0～500 μL。取適量靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品，加HPLC甲醇配制為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，4 ℃保存，作為每次進(jìn)樣時(shí)的對(duì)照品。

3.3.4 靈芝酸的含量測(cè)定

使用島津LC-2030高效液相色譜儀測(cè)定10種靈芝酸，各靈芝酸對(duì)照品相對(duì)靈芝酸A的近似相對(duì)保留時(shí)間如表2所示。

表2 靈芝酸對(duì)照品相對(duì)靈芝酸A的近似相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 The approximate relative retention time of each ganoderic acid compared with that of ganoderic acid A

圖1 靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品及赤芝樣品中各靈芝酸HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ganoderic acid A and each ganoderic acid in G.lingzhi sample

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品靈芝酸A(峰6)的保留時(shí)間與其他9種靈芝酸的相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn)峰1，2，3，4，5，6，7，8，10分別為靈芝烯酸C，靈芝酸C2，靈芝酸G，靈芝烯酸B，靈芝酸B，靈芝酸A，靈芝酸H，靈芝烯酸D，靈芝酸F。靈芝酸D出峰時(shí)間在34.2 min，所有樣品中靈芝酸D含量都小于0.04%，峰無(wú)法顯示。分別計(jì)算赤芝子實(shí)體中每種靈芝酸的百分比：含量測(cè)定結(jié)果=(ru/rs)×Cs×(V/W)×F×100%。ru=樣品溶液中相關(guān)分析物的峰面積，rs=標(biāo)準(zhǔn)溶液A中的靈芝酸A的峰面積，Cs=標(biāo)準(zhǔn)溶液A中靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mg/mL)，V=樣品溶液的體積(mL)，W=用于制備樣品溶液的靈芝子實(shí)體的重量(mg)，F(xiàn)=相對(duì)于靈芝酸A的相對(duì)響應(yīng)因子。

4 結(jié)果

海南橡膠林下不同栽培方式獲得的赤芝子實(shí)體，其多糖含量如表3所示。與對(duì)照即安徽闊葉林下埋土栽培的赤芝子實(shí)體中多糖的含量相比，海南橡膠林下不同栽培方式獲得的赤芝子實(shí)體的多糖含量均較高，且和對(duì)照均有明顯差異。另外，海南橡膠林下三種栽培方式對(duì)赤芝子實(shí)體中多糖含量的影響無(wú)明顯差異。

表3 海南橡膠林下不同栽培方式赤芝子實(shí)體的多糖含量Tab.3 The content of total polysaccharides in the fruit body of G.lingzhi cultivated by different methods under artificial forests of H.brasiliensis in s.d.，n=3)

海南橡膠林下不同栽培方式中赤芝子實(shí)體的靈芝酸含量如表4所示。對(duì)照即安徽闊葉林下埋土栽培的赤芝子實(shí)體，其靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸A、靈芝酸H、靈芝烯酸D、靈芝酸F、總靈芝酸含量均高于海南橡膠林下三種栽培方式的赤芝子實(shí)體，且具有顯著性差異。海南橡膠林下埋土栽培方式獲得的赤芝子實(shí)體靈芝酸C2含量最高；埋土及半埋土栽培方式的赤芝子實(shí)體中靈芝酸B含量較高；不埋土和半埋土栽培方式獲得的子實(shí)體，其靈芝烯酸C2較高。

表4 海南橡膠林下不同栽培方式赤芝子實(shí)體的靈芝酸含量Tab.4 The content of ganoderic acids in the fruit body of G.lingzhi cultivated by different methods under artificial forests of H.brasiliensis in s.d.，n=3)

5 討論

海南是中國(guó)最大的天然橡膠主產(chǎn)區(qū)和種植基地[8]，具有豐富的橡膠林下空間，那么如何利用這些空間，使其獲得更好的林農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益，是當(dāng)下要解決的一個(gè)重要問(wèn)題。目前，橡膠林復(fù)合種植模式被認(rèn)為是解決這些問(wèn)題的有效手段[9]。國(guó)內(nèi)，橡膠林下有橡膠-大葉千斤拔、橡膠-茶葉、橡膠-益智、橡膠-可可等多種復(fù)合種植模式[9]。雖然也有橡膠-靈芝的復(fù)合種植模式，但卻沒(méi)有受到足夠重視，且缺少深入的研究[10]。本研究采用赤芝段木菌棒不埋土、半埋土、全埋土三種不同的栽培方式，并對(duì)其多糖和靈芝酸含量進(jìn)行測(cè)定。研究結(jié)果表明，栽培方式對(duì)赤芝子實(shí)體多糖含量沒(méi)有顯著影響(表3)，但海南橡膠林下三種栽培方式獲得的子實(shí)體多糖含量均比對(duì)照即安徽闊葉林下埋土栽培的赤芝子實(shí)體多糖含量高，且具有顯著性差異(表3)。這說(shuō)明橡膠林下適合栽培對(duì)多糖含量要求高的赤芝子實(shí)體。此外，在2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定紫外分光光度法檢測(cè)的總多糖含量不得少于干重的0.9%，本研究中各種不同栽培方法下，其多糖的含量均達(dá)到了《中國(guó)藥典》規(guī)定的量。

靈芝酸結(jié)構(gòu)和種類多樣，具有多種藥理作用。日本對(duì)靈芝商品及靈芝制品中的靈芝酸非常重視，是鑒定商品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為三萜類靈芝酸含量越高，靈芝產(chǎn)品質(zhì)量越好。因此對(duì)各種靈芝酸的含量測(cè)定具有重要的意義。本論文中，海南橡膠林下不埋土和半埋土栽培方式獲得的子實(shí)體，其靈芝烯酸C較高；全埋土栽培方式獲得的子實(shí)體，其靈芝酸C2最高；半埋土和全埋土栽培方式獲得的子實(shí)體，其靈芝酸B較高(表4)；三種不同栽培方式對(duì)總靈芝酸的含量均沒(méi)有顯著影響(表4)。此外，《美國(guó)藥典》規(guī)定通過(guò)HPLC法檢測(cè)靈芝酸不得少于干重的0.3%，本研究中海南橡膠林下各種不同栽培方法獲得的子實(shí)體，其總靈芝酸的含量均達(dá)到了《美國(guó)藥典》規(guī)定的量。

在中國(guó)，各地因地制宜，采用合適的模式進(jìn)行赤芝的栽培。本論文采用的橡膠林下赤芝仿野生栽培，不僅符合海南省生態(tài)文明建設(shè)的需求，而且品質(zhì)優(yōu)良，其有效成分多糖和靈芝酸均達(dá)到或超過(guò)相關(guān)規(guī)定要求的量。此外，由于海南常年無(wú)冬，在全年的大部分時(shí)間段，赤芝都可以栽培和采收，而不像國(guó)內(nèi)其他地區(qū)，一年只能進(jìn)行一次栽培和一次采收。因此，綜合以上來(lái)看，在海南構(gòu)建橡膠-赤芝復(fù)合栽培模式是完全可行的。