張 亮，張志強，張 煜，劉 偉，伍 慶▲

(1貴州師范大學貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州 貴陽 550001；2貴陽市第三實驗中學創(chuàng)新實驗室，貴州 貴陽 550001；3國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550018；4貴州煙葉復烤有限責任公司技術(shù)中心，貴州 貴陽 550005)

柴石退熱顆粒由柴胡、石膏、黃芩等十味藥材組成，具有清熱解毒、解表清里之功效，是經(jīng)反復篩選驗證具有良好退熱作用的中成藥，其中的黃芩、金銀花、大黃、蒲公英、連翹等都具有清熱解毒等功效[1-8]。目前關(guān)于柴石退熱顆粒的研究[9-13]主要集中在對乙型腦炎病毒等相關(guān)方面，對其化學成分的研究較少。目前研究僅對黃芩、金銀花、大黃等做定性，對黃芩苷做定量測定。中藥復方制劑通過多成分、多靶點協(xié)同作用發(fā)揮其功效[14]，因此研究多種化學成分具有一定意義。故本研究采用高效液相色譜法測定柴石退熱顆粒中8種成分的含量，為其質(zhì)量控制提供方法參考。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)；AL-204 電子天平( 瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 藥品與試劑

黃芩苷、綠原酸、大黃素、漢黃芩素、漢黃芩苷、連翹苷、黃芩素、咖啡酸(批號110715-200212、110753-200212、0756-200110、111514-200403、112062-201702、110821-201816、111595-200306、110885-200102)均購自中國藥品生物制品檢定所；三批柴石退熱顆粒(批號：200101/200501/200601)均購自于市場；乙腈(HPLC)、甲酸(HPLC)、甲醇(分析純)均購自國藥集團化學試劑有限公司；水(自制超純水)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil? C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動相：0.12%甲酸乙腈溶液(A)-0.12%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，2%A→6%A；5～15 min，6%A→11%A；15～25 min，11%A→22%A；25～30 min，22%A→24%A；30～32 min，24%A→28%A；32～40 min，28%A→28%A；40～45 min，28%A→37%A；45～55 min，37%A→45%A；55～65 min，45%A→58%A；65～70 min，58%A→65%A)；流速：1.0 mL/min；檢測波長270 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液

精密稱定對照品黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、連翹苷、咖啡酸、綠原酸和大黃素適量，甲醇制得濃度分別為72.00 μg/mL、3.24 μg/mL、3.40 μg/mL、2.80 μg/mL、13.68 μg/mL、0.84 μg/mL、4.50 μg/mL、6.00 μg/mL的混合標準溶液。

2.2.2 供試品溶液

精密稱取柴石退熱顆粒0.2 g于具塞錐形瓶中，加50%甲醇適量，稱重，超聲提取，補重，搖勻，濾過，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察

分別取供試品和對照品溶液各適量，注入色譜儀(圖1)。由圖1可知，分離度大于1.5，且峰形良好，理論板數(shù)按黃芩苷峰計大于4000。

圖1 混合對照品A和供試品B色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substances(A)and sample(B)

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取不同濃度對照品溶液，注入色譜儀，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸(表1)。

表1 線性回歸方程考察結(jié)果Tab.1 Investigation results of linear regression equation

2.3.3 精密度試驗

分別吸取混合對照品溶液6份，注入色譜儀，計算黃芩苷、黃芩素等峰面積，其RSD分別為1.8%、1.6%、1.9%、2.1%、1.5%、2.2%、1.8%、2.6%，表明儀器具有良好的精密度。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取同一批次(批號：200101)柴石退熱顆粒，制備溶液，分別在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h測定，其RSD分別為2.4%、1.7%、1.9%、2.1%、1.3%、2.2%、1.8%、2.6%，均小于3.0%。

2.3.5 重復性試驗

取同一批次(批號：200101)柴石退熱顆粒，制備6份溶液，分別測定，其RSD分別為2.1%、2.3%、1.9%、2.1%、1.4%、1.6%、2.4%、1.7%，均小于3.0%。

2.3.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的柴石退熱顆粒(批號200101)0.1 g于錐形瓶中，分別加入適量對照品，制備溶液6份，測定含量(表2)。

表2 加樣回收率試驗測定結(jié)果Tab.2 Results of spiked recovery tests

2.4. 樣品檢測

取3批柴石退熱顆粒樣品，進行含量測定(表3)。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3，μg/mL)Tab.3 Content determination results of samples(n=3，μg/mL)

3 討論

1)提取溶劑的選擇

在對柴石退熱顆粒中主要成分提取過程中，本試驗研究采用甲醇、乙醇、無水乙醇、50%甲醇、70%乙醇等試劑對其中8種待測物進行提取，將提取得到的樣品溶液在液相色譜上進行分析，根據(jù)所得色譜峰的多少以及主峰的大小決定選取哪種試劑，主峰越大以及色譜峰越多，說明這種溶劑的提取效果越好。當采用50%甲醇作為提取液時，所得到的色譜峰較多，8種待測物的峰面積較大，最終選擇50%甲醇作為柴石退熱顆粒的提取溶劑。

2)流動相的選擇

本研究考察了甲醇、水、乙腈的流動相，而在進行等度洗脫試驗時，色譜峰之間的分離達不到要求(R<1.5)，當采用甲醇(A)和水(B)梯度洗脫時，它的分離效果沒有乙腈(A)和水(B)效果好，選擇加入適當甲酸以改善峰形，所以最終選擇0.12%甲酸乙腈(A)和0.12%甲酸水溶液(B)為流動相進行試驗。

3)檢測波長的選擇

通過PDA檢測器得到大黃素在255 nm和285 nm左右的吸收強度比較高，黃芩中4種待測黃酮類成分在278 nm左右的吸收強度比較高，連翹苷強吸收在280 nm，綠原酸強吸收在327 nm和246 nm，咖啡酸強吸收在323 nm，由于黃芩苷和綠原酸相對含量較高，在270 nm處待測物都符合分離要求，所以最終選擇270 nm作為檢測波長。

綜上，本試驗建立了柴石退熱顆粒中8種非同一類型物質(zhì)同時測定的方法，測定了3批柴石退熱顆粒樣品，說明建立的方法能夠應(yīng)用于柴石退熱顆粒中多指標成分的測定，為其質(zhì)量標準提升提供方法參考。