周雨馨，龐得全，田菲，韓朵，石書瑋

(河北省唐山市華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000)

0 引言

惡性黑色素瘤發(fā)病隱匿，惡性程度高，發(fā)生血行轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早，預(yù)后極差。大量的臨床研究資料證實(shí)，約占50%的MM最終死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%的MM發(fā)生于周身皮膚。皮膚惡性黑色素瘤(Cutaneous malignant melanoma，CMM)是一種神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞來源的惡性腫瘤，是致死性最大的皮膚腫瘤[1]。目前，對(duì)于早期的惡性黑色素瘤多采用手術(shù)切除，術(shù)后根據(jù)其病情發(fā)展可選擇放、化療，但該疾病早期轉(zhuǎn)移率高，單純放、化療敏感性較差，療效一般。隨著對(duì)黑色素瘤分子生物學(xué)的深入研究，黑色素瘤轉(zhuǎn)化的主要細(xì)胞通路在于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路、酪氨酸激酶受體(TKR)途徑等，科學(xué)家們針對(duì)黑色素瘤的不同作用靶點(diǎn)研制出一系列抗腫瘤藥物用于其治療[2]。時(shí)至今日，靶向藥物已進(jìn)入臨床應(yīng)用，而針對(duì) β-catenin及DKK1基因的研究仍處于機(jī)制探索階段，兩者在 CMM中的聯(lián)合研究在文獻(xiàn)中少有報(bào)道。因此，本研究就天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院五年的 MM 收治情況和預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行分析探討，然后進(jìn)一步探索β-catenin、DKK1在皮膚惡性黑色素瘤中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí) CMM 的預(yù)后因素、探討基于分子水平的發(fā)病機(jī)制、協(xié)同機(jī)制和促進(jìn)分子靶向藥物研發(fā)等起到一定的促進(jìn)作用。

1 資料與方法

1.1 患者資料

回顧性分析2005年1月至2009年12月在在天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診并治療的190例MM患者病歷資料。從中篩選出經(jīng)組織病理學(xué)確診為CMM且術(shù)前均未有手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療和免疫治療史的患者共30例。(1)初選切片：隨機(jī)收集病例庫中CMM病理切片30例納入CMM組，瘤周相應(yīng)正常皮膚組織30例作為對(duì)照組。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)合HE和免疫組織化學(xué)染色情況，剔除切片中無瘤組織、破碎瘤組織、CMM轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織、染色過程中脫片等無效切片，剔除病歷隨訪中死于其他疾病的無效切片。

1.2 染色

對(duì)所選切片進(jìn)行HE染色和免疫組化SP兩步染色法。

1.3 判定

β-catenin采用半定量檢測(cè)法[4]，DKK1采用Volm雙評(píng)分法[5]。根據(jù)陽性細(xì)胞在全部癌細(xì)胞中所占比例以及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

DKK1基因表達(dá)在免疫組織化學(xué)染色中主要以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，β-catenin基因表達(dá)在免疫組織化學(xué)染色中主要以細(xì)胞漿或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。首先根據(jù)著色的程度將表達(dá)強(qiáng)度分為：0分：無著色；1分：淺黃色：2分：棕黃色；3分：棕褐色。根據(jù)著色的細(xì)胞比例分別分為：DKK1：1分：≤25%；25%<2分≤50%；3分：>50%。β-catenin：0分：無陽性；1分：<10%；10≤2分≤50%；3分：>50%。β-catenin的表達(dá)情況以著色程度值與著色細(xì)胞比例值的乘積為結(jié)果，0分為陰性，≥1分為陽性；DKK1的表達(dá)以著色程度值與著色細(xì)胞比例值之和作為最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

首先對(duì)全部 30 例患者進(jìn)行一般情況分析，然后對(duì)納入統(tǒng)計(jì)分析的各組患者進(jìn)一步分析：Chi-Square Test 進(jìn)行 CMM 組和對(duì)照組間基因表達(dá)差異分析，Spearman秩相關(guān)進(jìn)行各基因之間及各基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性分析，Kaplan-Meier法Log-Rank 檢驗(yàn)進(jìn)行基因表達(dá)的單因素生存分析，均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

回顧性分析5年來天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院納入統(tǒng)計(jì)分析的190例患者中總中位生存時(shí)間為43.1個(gè)月。30名CMM患者的一般特征見表1。男女比1.14∶1。初診年齡40～90歲，中位發(fā)病年齡56歲。50歲以后發(fā)病居多，超過65歲的患者約占30%。發(fā)病部位以肢端(手足部)居多。

表1 30 例 CMM 患者的一般特征(n,%)

2.2 表達(dá)情況

(1)CMM組中β-catenin陽性表達(dá)15例，陽性率68.2%；對(duì)照組中陽性表達(dá)4例，陽性率18.2%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。(2)CMM組中DKK1陽性表達(dá)17例，陽性率68.0%；對(duì)照組中陽性表達(dá)5例，陽性率20.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 β-catenin、DKK1 在 CMM 組和對(duì)照組中的表達(dá)情況比較(n,%)

2.3 關(guān)系分析

(1)與CMM預(yù)后的關(guān)系分析：CMM組中β-catenin陽性表達(dá)15例，陽性率68.2%。單因素生存分析顯示β-catenin的表達(dá)可影響CMM的預(yù)后(P<0.05)；CMM組中DKK1陽性表達(dá)17例，陽性率68.0%。單因素生存分析顯示DKK1的表達(dá)不是CMM的預(yù)后影響因素(P>0.05)，詳見表3。(2)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系分析：CMM組(β-catenin切片組)中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，其中9例β-catenin表達(dá)陽性，陽性率90.0%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，其中有6例β-catenin表達(dá)陽性，陽性率為50.0%；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈正相關(guān)(r=0.428，P<0.05)；CMM組(DKK1切片組)中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，全部9例DKK1的表達(dá)均為陽性，陽性率100%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，其中8例DKK1表達(dá)陽性，陽性率50.0%；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈正相關(guān)(r=0.514，P<0.05)。詳見表4。

表3 β-catenin、DKK1 的表達(dá)差異與CMM 的預(yù)后關(guān)系

表4 β-catenin、DKK1 的表達(dá)差異與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析(n,%)

2.4 β-catenin、DKK1的表達(dá)之間的相關(guān)性分析

CMM組β-catenin表達(dá)陽性的14例切片中，有10例DKK1也表達(dá)陽性。β-catenin表達(dá)陰性的7例切片中，有1例DKK1也表達(dá)陰性。β-catenin與DKK1的表達(dá)一致性52.4%(11/21)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.158，P>0.05)，詳見表5。

表5 β-catenin 與DKK1 表達(dá)之間的相關(guān)性分析

3 討論

惡性黑色素瘤惡性程度極高，在疾病早期容易發(fā)生淋巴結(jié)及血行轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后差，晚期患者中位生存期僅為7.5個(gè)月，2年生存率約為15%，5年生存率僅為5%[4]。黑色素瘤由神經(jīng)鞘細(xì)胞癌變發(fā)展而來，而神經(jīng)鞘細(xì)胞來源于外胚層，因此惡性黑色素瘤主要發(fā)生于皮膚[5]。對(duì)于晚期惡性黑色素瘤，50%～80%的患者可出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，8%～46%的患者可出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移[6]。與很多惡性腫瘤一樣，部分早期MM患者可通過手術(shù)得到根治，化療、放療及生物治療都是中晚期MM患者的傳統(tǒng)治療手段，但MM對(duì)上述治療措施均不敏感。而隨著對(duì)黑色素瘤機(jī)制研究的不斷深入及現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤免疫治療為改善患者預(yù)后帶來新希望[7]。學(xué)者們?cè)趷盒阅[瘤中研究的最多是Wnt/β-catenin信號(hào)通路，常被稱為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路[8]。持續(xù)異常激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路時(shí)可通過增加β-catenin下游靶基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)增加血供、抑制凋亡、加速增殖、促進(jìn)轉(zhuǎn)移的惡性結(jié)果，腫瘤易感性大大增加。DKK1在惡性腫瘤中的研究非常少，目前被認(rèn)為是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的傳統(tǒng)抑制劑。分子靶向藥物逐漸正承擔(dān)起愈發(fā)重要的角色。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)由β連環(huán)蛋白1(cateninbeta1，CTNNB1)基因編碼，是一種高保守的多功能分泌型蛋白，參與構(gòu)成WNT/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用[11]。β-catenin是WNT/β-catenin重要的節(jié)點(diǎn)，可通過與鈣黏蛋白作用參與細(xì)胞間黏附。研究表明β-catenin表達(dá)可下調(diào)鈣黏蛋白水平，因此β-catenin異常表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞間黏附作用減小、松散，進(jìn)而提高腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，CMM組織中β-catenin陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，β-catenin表達(dá)與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，正常細(xì)胞間黏附作用較強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)信息交流和物質(zhì)交換，而腫瘤細(xì)胞則相反，通過減弱細(xì)胞間黏附作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞脫落，然后發(fā)生惡性增殖和轉(zhuǎn)移，可能原因是β-catenin過表達(dá)會(huì)降低鈣黏蛋白水平，從而降低細(xì)胞間黏附作用，增加腫瘤細(xì)胞脫落和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。這與張攀[10]等研究結(jié)果一致。此外β-catenin高表達(dá)會(huì)使WNT/β-catenin通路持續(xù)處于激活狀態(tài)，使通路中下游分子突變，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此惡性程度高、相對(duì)較大的腫瘤更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[11]。

作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路中重要一環(huán)的DKK1，曾被作為經(jīng)典抑制劑進(jìn)行各種腫瘤的基礎(chǔ)研究，但現(xiàn)在越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)DKK1在不同研究條件下呈現(xiàn)出截然不同的結(jié)果。DKK1至少有兩種方式可關(guān)閉經(jīng)典Wnt信號(hào)通路[12]，一是Frizzled相關(guān)蛋白質(zhì)，通過競爭性抑制Frizzled與Wnt的結(jié)合；另一個(gè)就是DKK1，可與細(xì)胞膜上的Wnt受體LRP5/6、共受體Kremen1/2結(jié)合，形成聚合物后內(nèi)吞，關(guān)閉Wnt信號(hào)，終止靶基因異常轉(zhuǎn)錄進(jìn)程。此外，DKK1是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的靶基因，其啟動(dòng)子區(qū)域有β-catenin結(jié)合位點(diǎn)，部分研究認(rèn)為轉(zhuǎn)錄生成的DKK1可以通過負(fù)反饋抑制上游基因的表達(dá)[13]，與信號(hào)鏈上其他因子共同維持著內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。關(guān)于DKK1在惡性腫瘤中的表達(dá)，研究者其實(shí)早已發(fā)現(xiàn)有多樣化的特點(diǎn)。在肝細(xì)胞癌、肝/腎母細(xì)胞瘤、NSCLC、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤中DKK1多表達(dá)增高，呈現(xiàn)促癌基因的特征，而在CMM、胃癌中，據(jù)報(bào)道DKK1表達(dá)降低，呈現(xiàn)抑癌基因的特征。有學(xué)者通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[14]，黑色素細(xì)胞中高表達(dá)的DKK1與CMM組織中的低表達(dá)形成鮮明對(duì)比，通過si-RNA沉默黑色素細(xì)胞中的DKK1后，則黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)高比例快速增殖能力。用Ad-DKK1腺病毒載體高效感染黑色素瘤A375細(xì)胞后[15]，高表達(dá)的DKK1明顯抑制了β-catenin的表達(dá)水平，而β-catenin的這一低水平表達(dá)在干擾DKK1的表達(dá)后明顯增高，從而推測(cè)β-catenin的表達(dá)下調(diào)受DKK1的影響，后者可抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，發(fā)揮對(duì)腫瘤進(jìn)程的抑制作用。本研究中，DKK1在CMM組中多呈陽性表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述學(xué)者的結(jié)論相反。我們基于本研究結(jié)論展望：DKK1的表達(dá)差異是否因人種而異；大樣本數(shù)據(jù)中DKK1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CMM預(yù)后的相關(guān)關(guān)系如何；DKK1作為傳統(tǒng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑為什么在一些研究中未發(fā)揮抑制劑的作用，除了已發(fā)現(xiàn)的β-catenin基因變異，是否存在或存在什么樣的干擾因素，我們的研究樣本中是否存在有統(tǒng)計(jì)意義的β-catenin基因變異？未來需擴(kuò)大樣本量、多區(qū)域、多種族、對(duì)臨床病理因素細(xì)分后進(jìn)一步研究。