羅靜，戴苗，劉曉亞，李小杰

（江南大學 a.合成與生物膠體教育部重點實驗室 b.化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122）

醫(yī)用金屬植入材料具有機械強度高、抗疲勞和易加工等優(yōu)良性能，已廣泛應用于心血管支架和骨修復等領域[1]。然而醫(yī)用金屬植入材料大多呈現(xiàn)生物惰性，不具備抗菌性能[2]，在植入過程中存在細菌感染的風險[3]。盡管經(jīng)過嚴格的消毒程序，術后患者的細菌感染率仍高達5%～35%[4]。為了減少感染率，醫(yī)生常給患者口服或靜脈注射抗生素[5]。但抗生素的過度使用可能會引起嚴重的副作用，并使細菌產(chǎn)生耐藥性。

針對細菌的生長特性，研究人員開發(fā)了一系列聚合物抗菌涂層[6-8]。其中，防污涂層采用水合作用和/或空間排斥機制來防止細菌的粘附，如聚乙二醇（PEG）[9]和兩性離子聚合物[10]。然而防污涂層通常沒有殺菌能力。一旦涂層表面有細菌粘附，將無法繼續(xù)有效抵抗細菌，少數(shù)附著的細菌最終也會生長成生物膜。殺菌涂層則通過破環(huán)細胞膜的完整性而造成細胞質泄露的機制來殺死細菌，主要包括季銨鹽聚合物[11]和抗菌肽[12]。然而殺菌涂層存在死細菌和其他碎片積累的問題。這不僅覆蓋了殺菌活性中心，降低了對后來附著細菌的殺菌效果，還可能觸發(fā)免疫反應或炎癥。而簡單地將防污和殺菌功能結合在一起所制備的涂層并不能充分展現(xiàn)其抗菌功能。因此近年來，越來越多的研究人員嘗試將刺激響應性功能加入到抗菌涂層的設計中。在外部刺激的作用下，例如水合[13]、pH[14]、光照[15]、溫度[16]和鹽濃度[17]，涂層能夠實現(xiàn)從防污到殺菌功能的切換。但外部刺激難以應用于人體，這顯然限制了它們的應用。徐福建等人[18]在整形外科植入材料領域開發(fā)了一種pH 響應的表面。這種表面可以對細菌感染做出反映而無需外部刺激，為聚合物抗菌涂層領域提供了新思路。

本研究以DMAEMA-8C、MAEBA 和EHA 作為共聚單體，制備了一種季銨鹽聚合物PMQE-CHO，并利用浸涂技術將其涂覆在不銹鋼316L（SS）表面制備季銨鹽聚合物涂層SS-PMQE-CHO。隨后使用PEG-NH2對季銨鹽涂層SS-PMQE-CHO 表面進行接枝改性，得到pH 響應性聚合物涂層SS-PMQE-PEG。通過模擬涂層表面發(fā)生細菌感染時的微環(huán)境，研究SS-PMQE-PEG 涂層在不同pH 條件下的抗菌性能。

1 試驗

1.1 原料與試劑

試劑包括：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA，99%），上海麥克林生化科技有限公司；1-溴辛烷（99%）、4-羥基苯甲醛（98%）、2-溴乙醇（96%）、甲基丙烯酰氯（95%）、甲基丙烯酸異辛酯（EHA，99%）偶氮二異丁腈（AIBN，99%），阿拉丁試劑上海有限公司；端氨基聚乙二醇（PEG-NH2），西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；碳酸鉀（K2CO3，AR）、氯化鈉（NaCl，CP）、無水硫酸鎂（MgSO4，AR）、三乙胺（Et3N，CP）、乙腈（CH3CN，CP）、石油醚（AR）、乙酸乙酯（AR）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，AR）、二氯甲烷（DCM，AR），國藥集團化學試劑有限公司；硅膠（200-300 目），青島海洋化工有限公司。

原料采用316L 不銹鋼盤片（SS，直徑為3 mm，厚度為0.3 mm，博美金屬材料有限公司），依次用400目和2000 目砂紙打磨，經(jīng)乙醇和丙酮清洗后待用。

1.2 試驗過程

1.2.1 DMAEMA-8C 的合成

參照文獻[19]中的制備方法，將 1-溴辛烷與DMAEMA 按照物質的量比為1.1∶1 添加至燒瓶中，加入乙腈作為溶劑（0.65 g/mL）?；旌衔镌?0 ℃下攪拌2 d。將所得到的溶液濃縮后，于無水乙醚中沉淀3 次，并在室溫下真空干燥，得到白色粉末DMAEMA-8C，產(chǎn)率約為97.3%。DMAEMA-8C 的合成路線見圖1。

圖1 DMAEMA-8C 的合成路線Fig.1 Synthesis route of DMAEMA-8C

1.2.2 HEBA 的合成

參照文獻[20]中的制備方法，利用1 L 的燒瓶，將4-羥基苯甲醛（20.0 g，0.163 mol）溶解在500 mL DMF 中。在機械攪拌期間，依次加入碳酸鉀（68.0 g，0.492 mol）和2-溴乙醇（20.5 g，0.163 mol）。使混合物在120 ℃的氮氣氛圍中反應36 h。反應結束后，將混合物過濾濃縮，利用DCM 和飽和氯化鈉水溶液進行萃取。有機層用無水硫酸鎂干燥處理，經(jīng)濃縮得到的粗產(chǎn)物為橘色固體。粗產(chǎn)物通過柱層析法純化（SiO2，石油醚-乙酸乙酯（1∶1））后，得到白色固體HEBA，產(chǎn)率約為54.1%。

1.2.3 MAEBA 的合成

在冰水浴的條件下，將甲基丙烯酰氯（6.5 g，0.062 mol）溶解在60 mL DCM 中，配制的溶液滴加至180 mL 溶有HEBA（9.1 g，0.055 mol）和Et3N（6.6 g，0.064 mol）的DCM 中。待體系恢復至室溫后攪拌2 h。反應結束后，有機層經(jīng)飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鎂干燥，濃縮后得到的粗產(chǎn)物為橙色油狀液體。粗產(chǎn)物通過柱層析法純化（SiO2，石油醚-乙酸乙酯（4∶1））后，得到白色固體MAEBA，產(chǎn)率約為42.5%。HEBA 和MAEBA 的合成路線見圖2。

圖2 HEBA 和MAEBA 的合成路線Fig.2 Synthesis route of HEBA and MAEBA

1.2.4 聚合物PMQE-CHO 的合成

本文通過自由基聚合制備共聚物P(MAEBA-r-DMAEMA-8C-r-EHA)，簡稱PMQE-CHO。將MAEBA、DMAEMA-8C 和EHA 分別按照物質的量比為3∶2∶5 以及4∶1∶5 溶解在DMF 中（0.1 g/mL），并加入1%（質量分數(shù)）的AIBN 作為引發(fā)劑，通過冷凍-抽氣-融化三次循環(huán)，將反應體系置換成氮氣氛圍，在65 ℃下反應24 h。反應結束后，將反應液濃縮，于乙醚中沉淀3 次，經(jīng)50 ℃真空干燥后，得到白色固體，分別命名為PMQE-CHO-30 和PMQE-CHO-40。共聚物PMQE-CHO 的合成路線見圖3。

圖3 共聚物PMQE-CHO 的合成路線Fig.3 Synthesis route of copolymer PMQE-CHO

1.2.5 涂層的制備

將SS 圓盤浸入PMQE-CHO-30 的DMC 溶液（0.3 g/mL）中60 s，然后取出，在空氣中干燥30 s，將該操作重復3 次得到SS-PMQE-CHO-30 涂層。將SSPMQE-CHO-30 涂層浸入PEG-NH2（Mw=2000 Da）的PBS 溶液（10 mg/mL）中，并在30 ℃下攪拌36 h。反應結束后，經(jīng)去離子洗滌，待自然干燥后，得到SS-PMQE-PEG-30 涂層。將SS-PMQE-PEG-30 涂層在HAc-NaAc 緩沖液（pH=5.0）中浸泡24 h，經(jīng)去離子洗滌，待自然干燥后，得到SS-PMQE-RE-30，席夫堿基團的pH 響應性見圖4。涂層SS-PMQE-CHO-40、SS-PMQE-PEG-40 和SS-PMQE-RE-40 的制備過程與上述相同。

圖4 席夫堿基團的pH 響應性Fig.4 The pH responsiveness of schiff base group

1.3 測試與表征

1.3.1 物理化學性質

采用瑞士布魯克公司的 AVANCE Ⅲ NMR 400 MHz 核磁共振儀對 DMAEMA-8C、HEBA、MAEBA、PMQE-CHO-30 和PMQE-CHO-40 進行1H NMR 表征，以氘代氯仿（CDCl3）或氘代二甲亞砜（DMSO-d6）為溶劑。采用美國賽默飛公司的ESCALAB MK II X 射線光電子能譜（XPS）測試涂層表面的化學成分。采用日本日立株式會社S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM）對SS-PMQE-CHO-30、SS-PMQE-PEG-30、SS-PMQE-CHO-40 和SS-PMQEPEG-40 的表面形貌進行表征。采用香港基恩士有限公司的VHX1000C 超景深三維顯微鏡觀察涂層的粗糙程度。采用德國Dataphysics 公司的OCA15EC 視頻光學接觸角測量儀對涂層的親疏水性進行測量。

1.3.2 涂層的防污和殺菌性能

所有樣品均在紫外燈下滅菌40 min。借助熒光標記牛血清白蛋白（FITC-BSA，Solarbio）研究防污性能[18]。先將涂層在37 ℃的PBS 中浸泡2 h，然后轉移至含有0.25 mg/mL FITC-BSA 的PBS 中，并在37 ℃下黑暗孵育2 h。洗滌干燥后，通過熒光顯微鏡（日本 Nikon 80i）觀察粘附在涂層表面的 FITCBSA。

選用大腸桿菌作為代表性菌研究防污和殺菌性能。將樣品置于96 孔板中，分別加入200 μL 的細菌懸浮液（大腸桿菌ATCC 8739，108CFU/mL，PBS），在37 ℃下孵育10 h。隨后將樣品輕輕洗滌，并用SYTO 9 和PI 染色。通過激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡TCS SP8）觀察涂層表面細菌的狀態(tài)，并進行定量統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3.3 涂層的防污殺菌轉換性能

所有樣品均在紫外燈下滅菌40 min。將樣品置于96 孔板中，分別加入200 μL 細菌懸浮液（大腸桿菌ATCC 8739，105CFU/mL，LB），在37 ℃下孵育10 h或24 h。隨后將樣品輕輕洗滌，并用SYTO 9 和PI染色。通過激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡TCS SP8）觀察涂層表面細菌的狀態(tài)，并進行定量統(tǒng)計數(shù)據(jù)。為了測試涂層性能的穩(wěn)定性，將樣品在37 ℃的PBS 中孵育兩周后，重復上述實驗。

1.3.4 涂層的細胞相容性

1）涂層的細胞粘附性。將樣品置于24 孔板中，在L929 細胞懸液中培養(yǎng)24 h 或48 h，經(jīng)FDA/PI 溶液染色，溫育15 min 后，使用熒光顯微鏡（日本Nikon 80i）觀察細胞在樣品表面的生長狀態(tài)。

2）涂層的細胞毒性。將樣品置于24 孔板中，在DMEM 培養(yǎng)基中浸泡24 h，然后使用浸提液培養(yǎng)L929 細胞24 h 或48 h，通過MTT 法測定樣品表面所粘附細胞的相對增殖度，見式(1)。

1.3.5 溶血試驗

將樣品置于24 孔板中，添加2 mL 稀釋后的新鮮豬血，在37 ℃下孵育1 h。將只含有PBS 緩沖液的孔作為陰性對照，含有蒸餾水的孔用作陽性對照。將懸浮液離心分離出上清液后，測量450 nm 處的吸光度，使用公式(2)計算溶血率（Hemolysis ratio，HR）。

2 結果及分析

2.1 物理化學性質

圖5 為所制備單體DMAEMA-8C、HEBA、MAEBA 及共聚物PMQE-CHO-30 和PMQE-CHO-40的核磁氫譜圖。如圖5d 所示，化學位移9.86×10-6、7.75×10-6、6.95×10-6處的信號峰分別歸屬于HEBA結構中醛基Ha 以及苯環(huán)Hb 和Hc 上的質子峰；化學位移 3.97×10-6～3.24×10-6處的信號峰歸屬于DMAEMA-8C 結構中與季碳原子相鄰甲基Hh、亞甲基Hg 和Hi 上的質子峰；化學位移4.92×10-6～3.95×10-6處的信號峰歸屬于共聚物結構中與氧原子相鄰碳原子上的質子峰Hd、He、Hf 和Hm；化學位移2.39×10-6～0.28×10-6處為共聚物主鏈以及側鏈烷基鏈上的質子峰。通過MAEBA、DMAEMA-8C 和EHA的特征峰Ha、Hg—i 和Ho 面積進行積分，得出共聚物PMQE-CHO-30 和PMQE-CHO-40 中各結構單元的比為3.0∶1.9∶5.8 和4.0∶1.4∶5.6。

圖5 各單體和共聚物的核磁氫譜圖Fig.5 1H NMR spectra of (a) DMAEMA-8C, (b) HEBA, (c) MAEBA and (d) copolymer PMQE-CHO-30 and PMQE-CHO-40

涂層的表面形貌如圖6a 和圖6b 所示。經(jīng)聚合物涂覆和PEG 改性后，涂層的表面形貌發(fā)生了輕微的變化。通過X 射線光電子能譜（XPS）分析樣品的化學組成。其中，SS、SS-PMQE-CHO-30、SS-PMQEPEG-30、SS-PMQE-CHO-40 和SS-PMQE-PEG-40 的C1s 能譜圖如圖6c 所示。譜圖中284.9、289.0、286.6、284.4 eV 處出現(xiàn)的峰值分別歸因于C—C、C—O、C==O 和C—N+。與SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQECHO-40 相比，經(jīng)PEG-NH2修飾后，SS-PMQE-PEG-30和SS-PMQE-PEG-40 的C==O 峰強度降低，并在結合能285.6 eV 處出現(xiàn)一個新峰，這歸因于C==N 的席夫堿結構。涂層的N1s 能譜如圖6d 所示。與不銹鋼SS相比，SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQE-CHO-40 的光譜在結合能 399.6 eV 處出現(xiàn) C—N+的新峰。經(jīng)PEG-NH2修飾后，在結合能396.7 eV 處出現(xiàn)一個新峰，這歸因于C==N 的席夫堿結構。

圖6 SS 和涂層樣品的微觀形貌和XPS 譜圖Fig.6 (a) SEM, (b) Ultra-depth microscope images, (c, d) XPS spectra of SS and coating samples

利用C1s 譜圖中醛基與季銨鹽基團的峰面積，計算涂層表面醛基與季銨鹽基團的比例。共聚物PMQECHO-30 中醛基與季銨鹽的物質的量比為1.579，但涂層SS-PMQE-CHO-30 表面[—C==O]/[C—N+]的物質的量比為1.093，涂層表面季銨鹽基團的含量明顯更高。這是由于季銨鹽的親水性較高，涂層浸泡在PBS溶液中時，季銨鹽基團會遷移到涂層表面。為了計算PEG-NH2的接枝效率，利用C1s 能譜圖中的席夫堿基團和季銨鹽基團作比較，涂層SS-PMQE-PEG-30 表面[—C==N—]/[—C==O]的物質的量比約為2.035，表明PEG/CHO 的物質的量比為2.035，因此席夫堿的反應效率是67.0%。利用同樣的方法可以計算出，涂層SS-PMQE-PEG-40 表面席夫堿的反應效率是81.1%。

利用水接觸角（WCA）測試評估涂層表面的親疏水性。如圖7 所示，SS 的WCA 約為88.9°。經(jīng)聚合物涂覆后，疏水性增加。由于SS-PMQE-CHO-30中季銨鹽的含量高于SS-PMQE-CHO-40，所以SSPMQE-CHO-40 的疏水性相對較高。經(jīng)PEG-NH2的接枝改性后，涂層的水接觸角降低。其中，SS-PMQEPEG-40 的WCA 最小，為76.8°。

圖7 涂層表面的水接觸角Fig.7 The water contact angles of coating surface

通過國家標準測試方法測定涂層機械性能，結果統(tǒng)計如表1 所示。涂層厚度約為5.1～11.6 μm，附著力均達到0 級，硬度HB～2H。以上結果表明，所制備涂層結構致密規(guī)整，機械性能優(yōu)異，有利于維持功能涂層在溶液環(huán)境中的穩(wěn)定性和對基材的保護作用。

表1 涂層的厚度和硬度Tab.1 The thickness and hardness of coatings

2.2 涂層的防污和殺菌性能

為了評估涂層的防污性能，將熒光標記的牛血清白蛋白（FITC-BSA）用作蛋白質污染的模型。利用熒光顯微鏡對涂層樣品表面蛋白質粘附情況進行分析，如圖8a 所示。同時基于熒光圖像，對每個樣品上BSA 的相對吸附量進行了分析，如圖8b 所示。SS、SS-PMQE-CHO-30、SS-PMQE-PEG-30、SS-PMQERE-30、SS-PMQE-CHO-40、SS-PMQE-PEG-40 和SSPMQE-RE-40 的灰度值分別為24.01、34.39、46.70、15.34、13.49、22.25 和19.43。由于蛋白質和SS 的疏水性相互作用，SS 表面吸附了大量的BSA。與SS 表面相比，SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQE-CHO-40 表面吸附的BSA 數(shù)量有所增加。這主要是由3 種相互作用所引起的：（1）SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQECHO-40 表面的疏水性大于SS；（2）磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.2）中的BSA 帶負電，季銨鹽基團會通過靜電相互作用吸引BSA 的粘附[21]；（3）涂層表面的醛基可以與BSA 中的氨基形成共價鍵[22]。經(jīng)過PEG 改性后，SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40表面的BSA 顯著減少。這表明SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 具有較高的防污能力。作為高度親水的聚合物，PEG 呈現(xiàn)電中性，可以通過氫鍵結合自由水分子并形成水合層以實現(xiàn)其防污性能[23]。SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 可能在PEG所形成的水合層的作用下，屏蔽了季銨鹽所帶的正電荷[18]，使得涂層具備防止蛋白粘附的性能。

圖8 涂層表面蛋白質吸附測試的熒光圖像照片和BSA 的相對吸附量Fig.8 Representative fluorescent images of protein absorption assay (a) and relative amounts of absorbed BSA on coatings (b)

為了評估涂層的防污和殺菌性能，選用大腸桿菌作為代表性菌，以1×108CFU/mL 的高密度在PBS 中進行測試。通過CLSM 觀察細菌在涂層表面的粘附情況，并根據(jù)CLSM 照片計算每組樣品的相對細菌數(shù)。如圖9 和圖10 所示，SS 具有疏水性，細菌易粘附在其表面。同時SS 不具備殺菌性能，因此有大量活菌在表面積聚。由于季銨鹽的存在，SS-PMQE-CHO-30和SS-PMQE-CHO-40 表現(xiàn)出一定的殺菌性能，殺菌效率分別為93%和90%，但仍有大量死細菌粘附在涂層表面。與SS 相比，在PEG 所形成的水合層的影響下，SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 對細菌具有良好的防污性能，細菌的粘附量分別減少了96%和98%。而SS-PMQE-RE-30 和SS-PMQE-RE-40 表面的PEG 在酸性條件下釋放，所以表面粘附的細菌數(shù)增加，分別表現(xiàn)出89%和87%的殺菌效率。

圖9 涂層表面大腸桿菌防污測試的CLSM 圖像Fig.9 Representative CLSM images of the antifouling test against E. coli on coatings

圖10 涂層表面大腸桿菌防污測試的定量統(tǒng)計數(shù)據(jù)Fig.10 Quantitative statistical data of the antibacterial test against E. coli on coatings

防污和殺菌測試結果表明，SS-PMQE-PEG 對BSA 蛋白質和大腸桿菌細菌具有良好的防污性能，當PEG 從表面釋放時，其殺菌性能得以恢復。

2.3 涂層的防污殺菌轉換性能

為了研究SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40涂層的防污和殺菌轉換性能，進行了細菌熒光標記實驗。利用激光共聚焦顯微鏡對涂層表面粘附的細菌進行觀察，并利用熒光強度定量計算活死細菌的數(shù)量，結果如圖11 和圖12 所示。在培養(yǎng)基中孵育10 h 后，SS 表面有大量的活細菌。顯然，SS 并沒有顯示出抗菌性能。涂層SS-PMQE-CHO-30 和SS-PMQE-CHO-40分別表現(xiàn)出93%和90%的殺菌效率，但死細菌都聚集在涂層的表面。這會降低涂層的長效殺菌能力。而在SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 的表面幾乎沒有細菌附著，與SS 相比，細菌總數(shù)減少了94%和96%。在10 h 的孵育過程中，培養(yǎng)基中細菌的密度不足以酸化微環(huán)境，因此涂層 SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 在短期感染過程中，顯示出防污性能，以抵抗細菌的粘附。在培養(yǎng)基中孵育24 h 后，細菌代謝活躍，涂層表面的微環(huán)境呈現(xiàn)弱酸性，以破壞席夫堿結構[24]。在這種情況下，席夫堿的斷裂會使涂層表面的PEG 釋放，從而暴露出底部的季銨鹽涂層。涂層功能由防污轉化為殺菌。此時，SS-PMQEPEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 分別顯示出93%和92%的殺菌效率。為了研究SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQEPEG-40 功能的長期穩(wěn)定性，對浸泡在PBS（pH 7.4）中兩周的SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 樣品進行了抗菌測試。孵育10 h 后，SS-PMQE-PEG-30和SS-PMQE-PEG-40 仍顯示出良好的防污性能，與SS 相比，附著的細菌減少了93%和97%。孵育24 h后，SS-PMQE-PEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 分別顯示出90%和88%的殺菌效率。這些結果表明，SS-PMQEPEG-30 和SS-PMQE-PEG-40 具有防污和殺菌轉換性能，并具有長期穩(wěn)定性。

圖11 涂層樣品和在PBS 中浸泡2 周的涂層樣品在大腸桿菌懸液中分別培養(yǎng)10 h 和24 h 的抗菌測試CLSM 圖Fig.11 Representative CLSM images of the antibacterial test against E. coli cultured for 10 h and 24 h of the as-prepared samples and samples soaked in PBS for 2 weeks

圖12 涂層樣品和在PBS 中浸泡2 周的涂層樣品在大腸桿菌懸液中分別培養(yǎng)10 h 和24 h 的抗菌測試定量統(tǒng)計數(shù)據(jù)（插圖顯示了樣品詳細的相對細菌數(shù)）Fig.12 Quantitative statistical data of the antibacterial test against E. coli cultured for 10 h and 24 h of the as-prepared samples and samples soaked in PBS for 2 weeks (the insets show the detailed relative bacterial count of samples)

2.4 涂層的細胞相容性

醫(yī)用金屬植入材料的表面性質對于細胞的粘附與增殖來說具有重要意義。采用小鼠胚胎成纖維細胞（L929 細胞）作為評價涂層材料體外細胞相容性的模型細胞，進行細胞實驗。

2.4.1 涂層的細胞粘附性

圖13 為L929 細胞在樣品表面分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后的熒光顯微鏡照片。培養(yǎng)24 h 后，涂層樣品表面均有細胞粘附。其中SS 作為性能優(yōu)異的醫(yī)用金屬植入材料，表面粘附有大量細胞。SS-PMQE-CHO涂層表面呈現(xiàn)出與SS 相同的生長態(tài)勢。而SS-PMQEPEG 涂層表面細胞的密度明顯降低。培養(yǎng)48 h 后，SS-PMQE-PEG 涂層樣品表面的細胞密度均有所增加，并且細胞結構飽滿、胞體輪廓清晰、邊緣光滑，呈健康的形貌。結果表明，所有涂層樣品均具有良好的細胞相容性，而PEG 的引入使得SS-PMQE-PEG 涂層表面親水性增加，其表面粘附的細胞數(shù)量有所降低。

圖13 L929 細胞在涂層表面培養(yǎng)24 h 和48 h 后細胞的熒光圖片F(xiàn)ig.13 Fluorescent microscopy images of L929 cells observed after 24 h and 48 h incubation on coatings

2.4.2 涂層的細胞毒性

在浸提液中培養(yǎng)24 h 和48 h 后，L929 細胞的活性如圖14a 和圖14b 所示。在培養(yǎng)24 h 后，細胞的活性與DMEM 中基本一致，均高于90%。細胞在SS-PMQE-CHO-30、SS-PMQE-PEG-30、SS-PMQECHO-40 和SS-PMQE-PEG-40 樣品的浸提液中培養(yǎng)48 h 后，活性分別為96%、96%、101%和98%。結果表明，浸提液中無有毒物質的釋放，或有毒物質的含量不會對細胞生長與增殖產(chǎn)生明顯影響。

圖14 L929 細胞在涂層樣品浸提液中培養(yǎng)24 h 和48 h 后的活性測試結果Fig.14 Cell viability of L929 cells after 24 h (a) and 48 h (b) incubation in leach liquor

2.5 溶血試驗

研究表明，季銨鹽聚合物可能會引起較高的溶血率[25]，但通過引入非離子基團可以改善血液相容性。為了研究涂層樣品的血液相容性，進行了溶血實驗，結果如圖15 所示。結果顯示，PEG 的引入的確降低了涂層的溶血率，但SS-PMQE-CHO 涂層的溶血率也小于5%。即涂層SS-PMQE-PEG 在防污殺菌行為切換前后均具有良好的血液相容性。

圖15 涂層樣品的溶血率Fig.15 The hemolysis ratio of coatings

3 結論

1）針對細菌的生長特性，通過pH 響應性功能設計，成功將防污和殺菌功能有機結合在一起，使涂層在不同環(huán)境中能展現(xiàn)出特定的功能。在正常環(huán)境下，涂層具有良好的防污性能，可以抵抗細菌粘附并防止感染惡化。當細菌增殖、代謝旺盛導致涂層表面的微環(huán)境變?yōu)槿跛嵝詴r，席夫堿結構發(fā)生斷裂，暴露出底部的殺菌層，涂層表面由防污轉換為滅菌，又展現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能。

2）體外細胞實驗表明，涂層具有較低的細胞毒性，細胞可以在涂層表面粘附并增殖。溶血實驗顯示，涂層的溶血率均低于5%，具有良好的血液相容性。