李春暉, 何程實, 吳建鑫, 韋張其, 楊少華, 劉國慶

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

雞胚在孵化過程中是以半封閉形式進行,其代謝產(chǎn)物只能依靠自身進行分解,如在生長發(fā)育過程中呼吸作用產(chǎn)生的自由基。雞胚在發(fā)育過程中需要大量的氧氣提供能量以維持機體的快速代謝等生命活動,從而導致產(chǎn)生更多的活性氧,而高水平的活性氧會造成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過氧化以及 DNA損傷[1]。因此存在于雞胚內(nèi)部的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、過氧化物酶(POD)等酶發(fā)揮作用清除活性氧,以保證發(fā)育過程中的氧化應激平衡。已有研究表明,在雞胚的發(fā)育過程中,不同組織中的相應抗氧化酶是不斷變化的[2-4],其中肝臟組織是雞胚中發(fā)揮抗氧化作用最顯著的器官。然而關于這些抗氧化相關的mRNAs研究卻報道不多,因此基于轉(zhuǎn)錄組測序技術篩選抗氧化相關的mRNAs并對其進行功能分析具有重要的研究意義。

近年來,隨著新一代轉(zhuǎn)錄組測序技術的發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術逐漸成為大規(guī)模研究轉(zhuǎn)錄組的一種新的且更為有效的方法[5]。RNA-seq技術是利用大規(guī)模測序技術直接對cDNA序列進行測序,產(chǎn)生數(shù)以千萬計的測序序列數(shù)量,從而使得一段特殊的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平可以直接通過比對到該基因組區(qū)域的測序序列數(shù)量來衡量[6]。文獻[7]研究表明不同發(fā)育時期牛胚胎的轉(zhuǎn)錄本與牛的基因組對比后發(fā)現(xiàn)了1 785個新的轉(zhuǎn)錄本;文獻[8]研究表明禽白血病病毒感染汶上蘆花雞和正常汶上蘆花雞肝臟轉(zhuǎn)錄組對比得到了1 446個新基因,其中1 058個新基因功能得到注釋;文獻[9]研究表明小尾寒羊和多賽特羊脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組對比研究發(fā)現(xiàn)了2個樣本之間存在602個差異表達基因。

目前,RNA-seq技術已經(jīng)用于研究魚[10-11]、小鼠[12]等各種類型的轉(zhuǎn)錄組,但對于雞胚轉(zhuǎn)錄組研究報道較少。基于抗氧化機制在雞胚發(fā)育過程中的重要作用,本研究以黑山雞胚肝臟組織作為研究對象,對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行篩選及富集功能分析,從而揭示在雞胚發(fā)育過程中調(diào)控抗氧化酶活力的關鍵候選基因。

1 材料與方法

1.1 主要材料

孵化至12、13、14、15、16、17、18 d的黑山雞胚蛋,每天的樣品做3次重復。

1.2 主要試劑與儀器

蛋白定量檢測試劑盒,超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒,組織勻漿機,酶標儀,臺式高速冷凍離心機,實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀,Nanodrop核酸蛋白檢測儀,凝膠成像系統(tǒng),電泳儀,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,DNA Marker,核酸染料等。

1.3 雞胚肝臟組織制備及其酶活測定

取出孵化至一定天數(shù)的雞胚蛋,消毒后置于無菌操作臺中取出肝臟組織,清洗,轉(zhuǎn)移至凍存管中,置于-80 ℃環(huán)境中保存,作為待測樣品。

制成10%組織勻漿,按照超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒說明進行測定。

1.4 RNA提取及質(zhì)量檢測

使用TRIZOL法提取12、16 d雞胚肝臟組織總RNA,在1%瓊脂糖凝膠上檢測RNA降解和污染。RNA純度采用超微量紫外分光光度計測定,以OD260、OD280、OD320值表示RNA純度。使用生物分析儀2100系統(tǒng)檢查完整度,測序要求動物樣品RNA完整值均需大于7,且電泳條帶中有清晰的28S和18S條帶,28S/18S大于1。

1.5 cDNA文庫的構(gòu)建和測序

樣本RNA經(jīng)過質(zhì)量檢測合格后,取3 μg作為cDNA文庫構(gòu)建的輸入材料。采用專門用于Illmina測序系統(tǒng)建庫。

1.6 實時熒光定量PCR檢測

獲得差異表達基因后,從中隨機挑選5個基因,從NCBI上下載對應基因的cDNA序列,進行引物設計,同時使用GAPDH作為內(nèi)參基因,引物設計使用軟件Primer5.0進行。引物設計完成后委托聯(lián)川生物有限公司合成。采用SYBR GREEN Ⅰ檢測樣品中靶標基因的表達量。

1.7 實驗數(shù)據(jù)分析

1.7.1 數(shù)據(jù)產(chǎn)出情況分析

高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(sequenced reads),即為原始測序序列(raw reads),其中包含測序序列(reads)的序列信息以及對應的測序質(zhì)量信息。為了保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量,需要將原始測序序列(raw reads)中帶接頭的、堿基信息無法確定率大于10%的以及低質(zhì)量的測序序列(reads)進行過濾,得到的序列信息為過濾后測序序列(clean reads),繼而在過濾后測序序列(clean reads)基礎上進行差異表達基因鑒定以及功能富集分析。

1.7.2 差異表達基因的鑒定

測序數(shù)據(jù)通過DESeq R軟件包進行差異分析,達到精確對比測序樣本間的差異表達。使用Benjamini和Hochberg的方法調(diào)整所得的P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。

1.7.3 差異表達基因的功能富集分析

GO富集可分為分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)和細胞組成(cellular component)3個部分。GO富集分析原理為超幾何分布,根據(jù)挑選出的差異基因計算這些差異基因與GO分類中某幾個特定的分支的超幾何分布關系,通過假設驗證得到一個特定P值,進而判斷差異基因是否在該GO中出現(xiàn)了富集。篩選差異表達基因后,通過GO功能富集分析能確定差異表達基因行使的主要生物學功能。以P≤0.05為閾值,篩選滿足此閾值的差異表達基因顯著富集的GO條目。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的綜合數(shù)據(jù)庫?？山柚鶮EGG 通路進行分析基因功能及表達信息,進而作為一個整體網(wǎng)絡進行研究。通路顯著性富集分析應用超幾何檢驗,找出與整個基因組背景相比,在差異表達基因中顯著性富集的通路。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 雞胚肝臟組織中抗氧化酶活性測定結(jié)果

2.1.1 SOD測定結(jié)果

對孵化至各天數(shù)的黑山雞胚肝臟組織按照試劑盒檢測標準進行測定,結(jié)果如圖1所示。圖1中,a、b、c表示顯著性差異，相同字母表示無顯著性差異，下同。

圖1 SOD活力測定結(jié)果

從圖1可以看出,雞胚在孵化后期肝臟組織中的SOD酶活性差異性變化趨勢。在雞胚基本成型的12 d時,達到(424.41±24.24) U/mg,后期逐漸下降,在孵化至16 d時達到最小值(329.48±11.22) U/mg。

2.1.2 GSH-Px測定結(jié)果

對孵化至各天數(shù)的黑山雞胚肝臟組織按照試劑盒檢測標準進行測定,結(jié)果如圖2所示。

圖2 GSH-Px活力測定結(jié)果

從圖2可以看出,雞胚在孵化后期肝臟組織中的GSH-Px活性呈現(xiàn)出差異性變化趨勢，孵化至12 d時酶活達到(33.44±2.65) U/mg,且與后期各天均具有顯著差異(P<0.05),16 d的雞胚肝臟組織GSH-Px酶活性最小,達到(18.19±2.09)U/mg。

酶活測定結(jié)果表明,12、16 d 的SOD酶活性與GSH-Px酶活性顯著差異,具有明顯表型極端值。因此,選取孵化至12、16 d雞胚肝臟組織作為后期轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒瀸ο笞詈侠怼?/p>

2.2 總RNA檢測結(jié)果

TRIZOL法提取12、16 d各3個樣品(編號為1～6)的總RNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行降解和污染程度檢測,結(jié)果如圖3所示，圖3中,M代表Marker;1～6分別代表Day12-1、Day12-2、Day12-3、Day16-1、Day16-2、Day16-3。

圖3 1%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果

圖3中的6個樣品均有2條清晰條帶,即28S和18S條帶,6個樣品的OD260/OD280值均大于1.9、OD260/OD230值均大于2.1,RNA完整值均大于9.5,表明總RNA完整性好、總RNA純度高,總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果見表1所列,檢測結(jié)果合格,能達到建庫要求。

表1 總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

通過Illumina測序平臺對6個樣品進行深度轉(zhuǎn)錄組測序。對測序結(jié)果進行測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估,包括測序錯誤率分布檢查、A/T/G/C含量分布檢查。將原始數(shù)據(jù)序列中含有帶接頭、低質(zhì)量的測序序列等進行過濾獲得過濾后測序序列。測序結(jié)果見表2所列。

本次測序每個樣本獲得了90 699 174～106 556 962個配對測序序列,去除帶接頭的、堿基信息無法確定率大于10%的以及低質(zhì)量的測序序列后,獲得了594 016 590個過濾后測序序列,6個樣品的總讀取長度為89.1×109堿基。

表2 樣品的基本測序數(shù)據(jù)

2.4 差異基因表達分析

將P≤0.05作為篩選差異基因的標準,檢查了12、16 d 2個樣本之間的差異表達基因表達譜。2組樣本間共獲得216個差異表達基因,其中81個上調(diào)基因,135個下調(diào)基因。部分顯著差異基因結(jié)果見表3所列。

表3 部分顯著差異基因

12、16 d 2個樣本之間的差異表達火山圖如圖4所示。

圖4 差異表達基因的火山圖

2.5 差異基因GO富集和KEGG通路分析

為了進一步評估差異表達基因的功能,進行差異基因GO富集功能分析。在列出的216個差異表達基因中,GO分析結(jié)果表明，3 140個GO terms里有421個GO terms顯著富集,可按照細胞成分、生物過程、分子功能分類,在這些GO terms中,與抗氧化有關的20個GO生物過程項顯著富集(P≤0.05)。其中包括:氧轉(zhuǎn)運體活性(GO:0005344)、氧氣輸送(GO:0015671)、氧結(jié)合(GO:0019825)、單加氧酶活性(GO:0004497)、氧化還原酶活性(GO:0016712)、氧化還原酶活性,作用于成對供體,與分子氧結(jié)合或還原(GO:0016705)、氧化還原法(GO:0055114)、氧化還原酶活性(GO:0016491)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0004364)等。部分通路詳細信息見表4所列。

表4 差異表達基因的GO分析

同時對KEGG通路進行分析,對富集情況以散點圖表示,如圖5所示。得到的71個通路中有8個通路被顯著富集(P≤0.05),其中包括“藥物代謝細胞色素p450”(gga00982)、“谷胱甘肽代謝”(gga00480)、“細胞色素p450對外源物質(zhì)代謝的影響”(gga00980)等通路與抗氧化酶活性相關。

2.6 實時熒光定量PCR測定

從測序結(jié)果篩選出的216個差異表達基因中隨機挑選5個差異表達基因進行實時熒光定量PCR測定,以驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 實時熒光定量PCR驗證差異基因表達

從圖6可以看出,實時熒光定量PCR測得的基因表達水平與RNA-seq得到的基因表達水平一致,從而證實了轉(zhuǎn)錄組測序平臺得到的數(shù)據(jù)是準確的。

3 討 論

本研究的目的是通過轉(zhuǎn)錄組測序技術尋找影響雞胚發(fā)育過程中抗氧化酶活性變化的關鍵候選基因。本文以雞胚肝臟組織作為研究對象,選取孵化至12、16 d的雞胚為研究材料,提取RNA,建立cDNA文庫,對轉(zhuǎn)錄本進行深度測序,并進行差異分析、功能分析，獲得了216個顯著差異表達基因,而一些基因具有已知的功能,例如HMOX2、CYP1A4、MAOA、GSTA、TTPA、MAT1A、GSTA3、MGST3等,也有研究報道這些基因與抗氧化酶活性有關[13-16]。在這些差異表達基因中,GSTA3(明顯下調(diào))、GSTA(明顯下調(diào))、TTPA(明顯上調(diào))、MGST3(明顯下調(diào))、HMOX2(明顯上調(diào))等被認為是影響雞胚發(fā)育過程中抗氧化酶活力的關鍵候選基因。

血紅素加氧酶(HO)是唯一已知的催化血紅素降解和一氧化碳(一種氣體信號分子)的哺乳動物酶[17]。血紅素代謝對于細胞來說至關重要,血紅素是許多氧轉(zhuǎn)運和氧化還原酶的蛋白質(zhì)的必要假體基因[18]。血紅素加氧酶有HO-1、HO-2和HO-3 3種同工型血紅素加氧酶2(HMOX2)在氧化還原、氧化還原酶活性、氧酸代謝等GO中都存在富集,且表達量明顯上調(diào)。在細胞應激狀態(tài)下,血紅素加氧酶發(fā)揮著重要作用,HO基因缺失的個體不能正常發(fā)育并且會增加對氧化損傷的敏感性[19]。 HO-1和HO-2具有相似的物理和動力學特性,但具有不同的生理作用和組織分布。HO-1是一種抗氧化和細胞保護酶[20],與缺少半胱氨酸殘基的HO-1不同,HO-2包含3個Cys-Pro標記,稱為血紅素調(diào)節(jié)基序(HRM),已知這些特征可控制細菌和人類有機體中鐵和氧化代謝有關的過程[21]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTA)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶3(GSTA3)是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)家族的成員,在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、氧酸代謝過程等GO存在富集,參與抗氧化功能調(diào)節(jié)。GSTA編碼屬于α類的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶,為肝臟和腎臟中細胞抗氧化劑防御機制的重要組成部分[22]。GSTA在使反應性親電試劑和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物解毒中起重要的細胞保護作用[23],包括GSTA在內(nèi)的GST先前已被確定為應激激酶的活性抑制劑,最著名的是c-Jun N端激酶[24]。GSTA3被稱為抗氧化蛋白酶,文獻[25]指出GSTA3敲除小鼠表現(xiàn)出增加的氧化損傷,并且一般認為GSTA3在體內(nèi)表現(xiàn)出氫過氧化物酶活性,其表達量的下調(diào)隨氧化應激水平而變化。

在微粒體谷光甘肽硫轉(zhuǎn)移酶,MGST作為膜結(jié)合蛋白之一，具有谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶活性在細胞及細胞器的抗氧化脅迫中扮演著重要角色[26]。微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶3(MGST3)屬于MGST家族,主要是催化外源性物質(zhì)及其活性親電子代謝產(chǎn)物與GSH親核巰基結(jié)合，起到解毒及保護機體的重要作用,并且可作為GSH-Px通過還原膜脂質(zhì)氫化物起到抗脂質(zhì)過氧化的作用[27]。

α生育酚轉(zhuǎn)移蛋白(TTPA)是一種約32 kDa的胞質(zhì)蛋白,具有明顯的配體特異性并選擇性識別α生育酚,后者是維生素E的最活躍形式[28],維生素E是大多數(shù)動物中主要的脂溶性抗氧化劑。有研究表明,永生化的人類肝細胞中TTPA基因的轉(zhuǎn)錄是由氧化應激和缺氧,核受體PPARα和RXR的激動劑以及cAMP水平升高引起的[29]。

4 結(jié) 論

本研究通過RNA-seq技術對孵化至12、16 d的雞胚蛋肝臟組織進行深度測序,獲得大量原始測序序列數(shù)據(jù),再對數(shù)據(jù)進行過濾、處理、篩選,共找出216個顯著差異表達基因。通過綜合分析差異表達基因、通路分析和基因功能分析,最后確定GSTA3、GSTA、TTPA、MGST3、HMOX2、GSTA1、ODC1、MAOA和GST可能是影響雞胚發(fā)育過程中抗氧化酶活力的候選基因,為后期的研究提供了一定的理論依據(jù)。