湯守元 蘭國(guó)玉 黃耿 朱鐘鐘 李新明 羅海平 姜進(jìn)平

1 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）胃腸肛腸外科，湖北435000；2 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）泌尿外科，湖北435000

胃癌是消化道腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率［1］。胃癌早期癥狀并不明顯，導(dǎo)致胃癌的早期診斷率較低［2］。闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)尋找新的診斷標(biāo)志物和治療策略具有重要意義。微小RNA（miR）是一種內(nèi)源性、非編碼、單鏈小分子RNA，廣泛表達(dá)于人體細(xì)胞［3］。miR通過(guò)抑制靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、分化等功能［4］。越來(lái)越多的研究證明，miR在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程起到關(guān)鍵作用［5］。miR-6886-5p是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miR，其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)和作用鮮有報(bào)道。2019 年10 月至2021 年1 月，本研究旨在檢測(cè)胃癌細(xì)胞株中miR-6886-5p 的表達(dá)，探討miR-6886-5p 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響以及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜上皮細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)于購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)（MTS）試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；LASP1 野 生 型（LASP1-WT）質(zhì) 粒 及LASP1 突 變 型（LASP1-MT）質(zhì)粒、miR-NC、miR-6886-5p 模擬物購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；所有抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，HS-746T、SGC7901 和GES-1 細(xì)胞采用含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，BGC823、MGC803采用含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將HS-746T 細(xì)胞分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染miR-NC）和miR-6886-5p 組（轉(zhuǎn)染miR-6886-5p 模擬物），按照Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 qRT-PCR 檢 測(cè)miR-6886-5p 和LASP1 mRNA 表達(dá) 使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。建立qRT-PCR 反應(yīng)體系，miR-6886-5p 表達(dá)量以U6 為內(nèi)參，LASP1 mRNA 表達(dá)量以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算 。 引 物 設(shè) 計(jì) 如 下 ，GAPDH 正 向 引 物 ：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 引 物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；miR-6886-5p 正向 引 物：5’-AGCCCTCATCTCATCTGC-3’，反 向 引 物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；LASP1 正 向 引 物：5’-TGCGGCAAGATCGTGTATCC-3’，反 向 引 物 ：5’-GCAGTAGGGCTTCTTCTCGTAG-3’；U6 正 向 引 物：5’-TGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTC-3’，反 向 引 物：5’-CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.4 MTS 法檢測(cè)HS-746T 細(xì)胞增殖水平 將各組HS-746T 細(xì)胞接種于96 孔板，進(jìn)行MTS 法檢測(cè)時(shí)，每孔加入20 μl MTS 試劑，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，連續(xù)檢測(cè)5次。

1.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HS-746T 細(xì)胞遷移能力 將各組HS-746T 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)95%，使用10 μl 槍頭在孔底劃痕，每孔加入2 ml 不含血清的培養(yǎng)基，于顯微鏡下測(cè)量劃痕寬度（W1）。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于顯微鏡下測(cè)量劃痕寬度（W2），HS-746T 細(xì)胞劃痕愈合率=（W1-W2）/W1×100%。

1.6 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-6886-5p 的靶基因 使用microRNA.org 預(yù)測(cè)miR-6886-5p 的靶基因，LASP1 可能是miR-6886-5p 的靶基因。將HS-746T 細(xì)胞接種于96 孔板，將miR-NC、miR-6886-5p 模擬物與LASP1-WT 或LASP1-MT 共轉(zhuǎn)染至HS-746T 細(xì)胞。培養(yǎng)48 h 后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.7 Western blot 檢測(cè)miR-6886-5p 的靶基因蛋白表達(dá) 使用RIPA 裂解液提取各組HS-746T 細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，使用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，在5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗在室溫孵育2 h。使用超敏ECL 發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，比較靶基因蛋白的表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌細(xì)胞株中miR-6886-5p 的表達(dá) 如圖1，正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 和胃癌細(xì)胞株HS-746T、BGC823、MGC803、SGC7901 中miR-6886-5p 的表達(dá)分別為（1.08±0.07）、（0.23±0.05）、（0.42±0.02）、（0.69±0.06）和（0.55±0.04）。與GES-1 相比，胃癌細(xì)胞株中miR-6886-5p的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表達(dá)最低的細(xì)胞是HS-746T 細(xì)胞（P＜0.01），因此選擇HS-746T細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 胃癌細(xì)胞株和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 中miR-6886-5p的表達(dá)

2.2 各組HS-746T 細(xì)胞中miR-6886-5p 的表達(dá) 對(duì)照組和miR-6886-5p 組中miR-6886-5p 的表達(dá)分別為（1.17±0.40）和（9.48±1.10），miR-6886-5p 組是對(duì)照組的8.10倍（P＜0.01）。

2.3 miR-6886-5p 對(duì)HS-746T 細(xì)胞增殖能力的影響如圖2，與對(duì)照組相比，miR-6886-5p 組細(xì)胞在第3、4、5 天的A值明顯降低（均P＜0.05），提示miR-6886-5p 可抑制HS-746T細(xì)胞增殖。

圖2 miR-6886-5p對(duì)兩組HS-746T細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 miR-6886-5p 對(duì)HS-746T 細(xì)胞遷移能力的影響對(duì)照組和miR-6886-5p 組細(xì)胞劃痕愈合率分別為（63.42±5.58）%和（27.41±4.87）%。與對(duì)照組相比，miR-6886-5p 組細(xì)胞劃痕愈合率明顯下降（P＜0.01），提示miR-6886-5p 可抑制HS-746T細(xì)胞遷移（圖3）。

圖3 miR-6886-5p對(duì)HS-746T細(xì)胞遷移能力的影響

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-6886-5p 的靶基因 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示（圖4），轉(zhuǎn)染LASP1-WT 后再轉(zhuǎn)染miR-6886-5p 的HS-746T 細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性較再轉(zhuǎn)染miR-NC 組明顯降低（P＜0.05），提示miR-6886-5p可靶向結(jié)合LASP1。

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-6886-5p 互補(bǔ)結(jié)合LASP1基因mRNA 3’UTR

2.6 miR-6886-5p對(duì)LASP1 mRNA表達(dá)的影響 對(duì)照組和miR-6886-5p 組細(xì)胞中LASP1 mRNA 的表達(dá)分別為（1.10±0.27）和（0.14±0.02），提示miR-6886-5p 可明顯抑制LASP1 mRNA的表達(dá)（P＜0.01）。

2.7 LASP1 蛋白及相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果表明（圖5），miR-6886-5p組HS-746T細(xì)胞LASP1蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞增殖蛋白CDK4 表達(dá)降低，細(xì)胞遷移蛋白Snail表達(dá)降低。

圖5 miR-6886-5p對(duì)兩組LASP1蛋白及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

miR 是近年來(lái)胃癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［6］。Ding 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p 在胃癌組織中低表達(dá)，上調(diào)miR-629 表達(dá)后胃癌細(xì)胞的增殖和遷移被抑制。He 和Zou［8］研究發(fā)現(xiàn)，miR-96-5p 在胃癌細(xì)胞系和胃癌患者血清中過(guò)表達(dá)，miR-96-5p 通過(guò)直接靶向叉頭框蛋白O3 基因，加速胃癌細(xì)胞的增殖。miR-6886-5p 對(duì)胃癌增殖和遷移能力的作用尚不明確。本研究顯示，miR-6886-5p 在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯低于正常胃黏膜上皮細(xì)胞，miR-6886-5p 可能表現(xiàn)為抑癌作用。本研究進(jìn)一步通過(guò)MTS法和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，上調(diào)miR-6886-5p 可明顯抑制HS-746T 細(xì)胞的增殖和遷移能力，miR-6886-5p在胃癌中表現(xiàn)為抑癌作用。

miR 主要通過(guò)與靶基因mRNA 不完全配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA 的降解或者抑制其翻譯，下調(diào)靶基因的表達(dá)［9］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件microRNA.org 預(yù)測(cè)顯示，miR-6886-5p 的靶基因可能是LASP1。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)，miR-6886-5p 能夠靶向結(jié)合LASP1 mRNA。miR-6886-5p 可能通過(guò)調(diào)控LASP1 基因表達(dá)發(fā)揮作用。LASP1基因位于染色體17q21，其翻譯的蛋白屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族［10］。近年來(lái)的研究顯示，LASP1 蛋白在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤中呈高表達(dá)，LASP1 蛋白能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等活動(dòng)［11］。下調(diào)LASP1蛋白表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移［12］。本研究通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR-6886-5p的HS-746T細(xì)胞中LASP1基因的表達(dá)明顯下降，表明miR-6886-5p可靶向抑制LASP1基因的表達(dá)。同時(shí)，細(xì)胞增殖蛋白CDK4表達(dá)降低，細(xì)胞遷移蛋白Snail表達(dá)降低，間接表明HS-746T細(xì)胞的增殖和遷移能力降低。

綜上所述，miR-6886-5p 在胃癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-6886-5p 可通過(guò)靶向抑制LASP1 基因的表達(dá)，降低胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。本研究可能為胃癌的診斷和治療提供新的標(biāo)志物和分子靶點(diǎn)。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。