葉志華 付金倫 桂定文 羅帥 王靜 王小英

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）泌尿外科腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 435000；2 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市第二醫(yī)院外科，湖北435000

腎癌源于腎小管上皮細(xì)胞，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年升高［1］。腎癌治療方式主要是手術(shù)切除，轉(zhuǎn)移性腎癌患者對(duì)放療和化療均不敏感［2］。探討腎癌增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)尋找診斷標(biāo)志物和靶向治療意義重大。lncRNA 是一種非編碼小RNA，缺乏開放閱讀框架［3］。lncRNA 在基因轉(zhuǎn)錄修飾、轉(zhuǎn)錄后修飾等方面發(fā)揮重要作用，參與心血管疾病、糖尿病、腫瘤等疾病發(fā)生和發(fā)展［4］。FGD5-AS1是一種新明確的lncRNA。研究表明，F(xiàn)GD5-AS1 在多種腫瘤中發(fā)揮明顯的癌基因作用［5］。FGD5-AS1 在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不明確。本研究于2020年7月至2021 年2 月通過檢測(cè)FGD5-AS1 在腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)，篩選FGD5-AS1 表達(dá)最高的腎癌細(xì)胞，探討下調(diào)FGD5-AS1 對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子6（suppressor of cytokine signaling 6，SOCS6）表達(dá)的調(diào)控及對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 所有細(xì)胞均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；胎牛血清（FBS）和培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；Lipofectamine 3000 和Matrigel 膠購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；陰性對(duì)照質(zhì)粒和小干擾siRNA-FGD5-AS1質(zhì)粒由廣州市銳博生物科技有限公司合成；二苯基溴化四氮唑藍(lán)（MTT）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa 公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 腎癌細(xì)胞786-O、ACHN、A498、OS-RC-2采用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，近端腎小管細(xì)胞采用含10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。ACHN 細(xì)胞以6×105個(gè)/孔接種于6 孔板，根據(jù)Lipofectamine 3000 說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染小干擾siRNA-FGD5-AS1 質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒，命名為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

1.3 qRT-PCR 檢 測(cè)FGD5-AS1 和SOCS6 mRNA 表 達(dá)應(yīng)用Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄RNA 為cDNA，根據(jù)qRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。Ct 值利用2-ΔΔCt方法計(jì)算，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物序列

1.4 Western blotting 檢測(cè) 蛋白提取試劑盒提取兩組腎癌ACHN 細(xì)胞總蛋白。分別取50 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 膠電泳，利用聚偏二氯乙烯膜轉(zhuǎn)膜，利用5%脫脂牛奶封閉，在一抗中孵育12 h，在二抗羊抗兔中孵育3 h，在凝膠成像系統(tǒng)下顯影、拍照。

1.5 MTT 法檢測(cè)ACHN 細(xì)胞的增殖 兩組腎癌ACHN細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔接種到96 孔板。每孔加入20 μl MTT 試劑孵育4 h，去上清，每孔加入180 μl 二甲基亞砜，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，連續(xù)5 d進(jìn)行MTT檢測(cè)。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACHN細(xì)胞的侵襲 預(yù)鋪Matrigel膠（濃度15 μg/ml）至小室上室。兩組腎癌ACHN 細(xì)胞使用無血清培養(yǎng)基重懸后接種于上室，加入600 μl 含血清培養(yǎng)基至下室。培養(yǎng)32 h，棉簽擦去未穿微孔膜的ACHN細(xì)胞。室溫下甲醇固定，室溫下結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡（×100）下計(jì)數(shù)并取均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR 檢測(cè)腎癌細(xì)胞中FGD5-AS1 的表達(dá)qRT-PCR 檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示，F(xiàn)GD5-AS1 在786-O、ACHN、A498、OS-RC-2、HK-2 細(xì)胞中的表達(dá)量分別為（3.92±0.29）、（5.81±0.53）、（1.66±0.18）、（3.03±0.16）和（1.01±0.06）。與HK-2 細(xì)胞相比，腎癌細(xì)胞中FGD5-AS1 表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），其中ACHN 細(xì)胞增加最為明顯（P＜0.05）。故以ACHN細(xì)胞為對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ACHN 細(xì)胞中FGD5-AS1、SOCS6 mRNA 的表達(dá) 在ACHN 細(xì)胞株中，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中FGD5-AS1 表達(dá)量分別為（1.01±0.09）和（0.20±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.46，P＜0.01）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中SOCS6 mRNA 表達(dá)量分別為（0.33±0.05）和（1.02±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.05，P＜0.01）。

2.3 Westen blotting 檢測(cè)SOCS6 蛋白和NF-κB 信號(hào)通路蛋白的相對(duì)表達(dá) Western blotting 顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組ACHN 細(xì)胞中SOCS6 蛋白表達(dá)明顯增加，NF-κB 信號(hào)通路蛋白NF-κB、c-Myc、ICAM-1 蛋白表達(dá)明顯降低，見圖1。

圖1 Western blotting 檢測(cè)兩組SOCS6 蛋白及NF-κB 信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)

2.4 MTT法檢測(cè)ACHN細(xì)胞的增殖能力 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染FGD5-AS1 后第3 天開始，細(xì)胞增殖能力明顯下降（t=3.86，P＜0.05），見圖2。

圖2 FGD5-AS1對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN細(xì)胞增殖能力的影響

2.5 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACHN 細(xì)胞的侵襲能力對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組ACHN 細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（80.49±10.50）個(gè)和（32.29±8.03）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（t=3.65，P＜0.05），這表明FGD5-AS1 可導(dǎo)致ACHN 細(xì)胞侵襲能力明顯降低。

3 討 論

lncRNA 主要通過RNA聚合酶Ⅱ的作用合成，一直以來被研究者們認(rèn)定為轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生的“噪音”，不發(fā)揮任何生物學(xué)效應(yīng)［5］。近來研究不斷證實(shí)，lncRNA 在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能方面發(fā)揮著巨大的潛力，越來越多l(xiāng)ncRNA 被鑒定在腎癌組織或細(xì)胞中異常高表達(dá)或者低表達(dá)，嚴(yán)重影響腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［6］。FGD5-AS1 是一種新明確的lncRNA，被發(fā)現(xiàn)在多個(gè)腫瘤中發(fā)揮明顯的癌基因作用［7］。FGD5-AS1在腎癌中的表達(dá)模式和分子機(jī)制尚不清楚。

本研究顯示，F(xiàn)GD5-AS1 在腎癌細(xì)胞株中相對(duì)表達(dá)明顯高于近端腎小管細(xì)胞，F(xiàn)GD5-AS1 高表達(dá)可能參與腎癌發(fā)生和發(fā)展。SOCS6 基因位于人的18q22.2 染色體，其由535 個(gè)氨基酸排列組成［8］。SOCS6 蛋白是一種E3 泛素連接酶，通過泛素化降解特定基因表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。SOCS6 蛋白在膀胱癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤呈現(xiàn)出明顯的低表達(dá)趨勢(shì)，展現(xiàn)出明顯抑癌基因作用［10］。有研究表明，F(xiàn)GD5-AS1 在牙周膜細(xì)胞中具有調(diào)控SOCS6 基因表達(dá)的作用［7］。本研究結(jié)果表明，下調(diào)FGD5-AS1可明顯促進(jìn)SOCS6基因的表達(dá)。NF-κB 信號(hào)通路的異常激活與腎癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可明顯促進(jìn)腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為［11］。本研究顯示，SOCS6 蛋白表達(dá)增加后，NF-κB 信號(hào)通路蛋白表達(dá)明顯降低，表明NF-κB 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制。本研究進(jìn)一步通過MTT 法和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)FGD5-AS1 后，腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力均呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)。本研究的不足之處在于，F(xiàn)GD5-AS1 調(diào)控SOCS6 基因表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，是本課題組下一步研究的重點(diǎn)。

總之，F(xiàn)GD5-AS1 在腎癌細(xì)胞株中高表達(dá)，下調(diào)FGD5-AS1 可通過正向調(diào)控SOCS6 基因表達(dá)、負(fù)向調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲。FGD5-AS1 的研究可能為腎癌的分子診斷、靶向治療等提供新的思路。