姜 羽 呂國(guó)偉 張文進(jìn) 張 輝

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤[1，2]。Wnt通路是細(xì)胞內(nèi)一條在進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路，分為4個(gè)分支，其中Wnt/β-catenin是經(jīng)典路徑，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多個(gè)方面具有調(diào)控作用[3，4]。研究表明，Wnt/β-catenin 通路的異常激活與膠質(zhì)瘤等多種腫瘤有關(guān)[3，4]?；倍▔A具有抗炎等藥理學(xué)活性[5]，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有調(diào)控作用[6，7]。本研究探討槐定堿對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，為膠質(zhì)瘤的治療尋找新的有效藥物提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640 培養(yǎng)液（美國(guó)Invitrogen 公司）中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行傳代。以5×105個(gè)/孔密度接種于6 孔板培養(yǎng)16 h，加入槐定堿（上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)060736，純度＞99.0%），濃度分別為0 mg/ml（對(duì)照組）、1.0（低劑量）、2.0（中劑量）、3.0（高劑量）mg/ml，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2 細(xì)胞遷移U87 細(xì)胞與槐定堿共培養(yǎng)24 h，不含胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中饑餓處理12 h；用10 μl 的移液槍頭垂直于板面劃痕，每4 h 觀察一次細(xì)胞遷移狀態(tài)，倒置熒光顯微鏡下拍照，作圖軟件處理，計(jì)算每組細(xì)胞24時(shí)和0時(shí)的劃痕寬度之比。

1.3 細(xì)胞侵襲U87 細(xì)胞與槐定堿共培養(yǎng)24 h，不含胎牛血清的培養(yǎng)基中饑餓處理12 h，胰蛋白酶消化后洗滌、離心，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密度約2×105個(gè)/ml；將Transwell 小室（上海Abcam公司）置于24孔板內(nèi)，加入300 μl完全培養(yǎng)液，室溫下靜置30 min，使基質(zhì)膠水化，向外室內(nèi)加入500 μl完全培養(yǎng)液，將200 μl 細(xì)胞懸液接種于小室內(nèi)，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行GISMA 染色，用棉簽擦拭小室內(nèi)側(cè)，流水沖洗染液；用手術(shù)刀片將膜取下，置于載玻片上，于倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并拍照；每張玻片取上下左右中5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，取平均數(shù)。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)U87細(xì)胞與槐定堿共培養(yǎng)24 h，用RIPA 細(xì)胞裂解液裂解，提取蛋白質(zhì)，凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至NC 膜，含5%脫脂奶粉的TBST 搖育封閉2 h，先后加入稀釋后的E-cadherin（1:1 000；美國(guó)Abcam 公司）、Vimentin（1:1 000；美國(guó)Abcam 公司）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopro?teinase，MMP）-9（1:1 000；美國(guó)Abcam公司）一抗、二抗（1:5 000），TBST 洗滌NC 膜；ECL 顯色；將膠片掃描后用Bandscan5.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)相關(guān)mRNA 水平U87 細(xì)胞與槐定堿共培養(yǎng)24 h，Trizol（美國(guó)Gibco公司）提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2 μl RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：內(nèi)參βactin 正義鏈5'-CTAGGCTAGCGCTAATCGAC-3'，反義 鏈5'-TCGGCATTTATTACGCTAGA-3'；Vimentin正義鏈5'-GCTTAGCGCCCTAGCTAGGCT-3'，反義鏈5'-TCGGCTTAGCCGATCGATC-3'；MMP-9 正義鏈5'-TAGCTTTCGTAGCCTAGCCT-3'，反義鏈5'-TAGGCTTCGTACGATAACGA-3'（上海生工生物工程有限公司合成）。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用圖像記錄分析系統(tǒng)對(duì)目的基因、參比基因的條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析；計(jì)量資料以±s表示，用多因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槐定堿對(duì)U87細(xì)胞形態(tài)的影響 對(duì)照組U87細(xì)胞為梭形間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)，呈現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epitheli?al-mesenchymal transition，EMT）形態(tài)變化；中劑量槐定堿組呈現(xiàn)正常上皮細(xì)胞形態(tài)。

2.2 槐定堿對(duì)U87 細(xì)胞遷移和侵襲活性的影響 與對(duì)照組相比，槐定堿組U87細(xì)胞遷移、侵襲活性顯著降低（P＜0.001），且隨藥物濃度的增加，遷移、侵襲活性明顯降低（P＜0.001）。見圖1、2。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槐定堿對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞遷移能力的影響（40×）與0 mg/ml組相比，a P＜0.05；與1.0 mg/ml組相比，b P＜0.05；與2.0 mg/ml組相比，c P＜0.05

圖2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)槐定堿對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞侵襲能力的影響（100×）與0 mg/ml組相比，a P＜0.05；與1.0 mg/ml組相比，b P＜0.05；與2.0 mg/ml組相比，c P＜0.05

2.3 槐定堿對(duì)U87 細(xì)胞β-catenin 和E-cadherin 蛋白表達(dá)的影響 槐定堿組U87 細(xì)胞β-catenin 蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.001），且隨藥物濃度的增加而明顯降低（P＜0.001）；槐定堿組U87細(xì)胞E-cad?herin蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.001），且隨藥物濃度的增加而明顯增高（P＜0.001）。見圖3。

圖3 免疫印跡法檢測(cè)槐定堿對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞β-catenin、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響與0 mg/ml組相比，a P＜0.05；與1.0 mg/ml組相比，b P＜0.05；與2.0 mg/ml組相比，c P＜0.05

2.4 槐定堿對(duì)U87細(xì)胞Vimentin和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 槐定堿組U87 細(xì)胞Vimentin 和MMP-9 mRNA 和蛋白表達(dá)這篇均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），且隨藥物濃度的增加明顯降低（P＜0.01）。見圖4、5。

圖4 免疫印跡法檢測(cè)槐定堿對(duì)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Vimentin、MMP-9蛋白表達(dá)的影響與0 mg/ml組相比，a P＜0.05；與1.0 mg/ml組相比，b P＜0.05；與2.0 mg/ml組相比，c P＜0.05

圖5 RT-PCR 檢測(cè)槐定堿對(duì)人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞Vimentin、MMP-9mRNA表達(dá)的影響

3 討論

EMT 指源于上皮的腫瘤細(xì)胞失去極性，向具有間質(zhì)表型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程[8]。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的異常激活是導(dǎo)致EMT 的重要因素[3，8～10]，該信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤的發(fā)展有密切關(guān)系[11]。

槐定堿是中藥苦豆子的有效活性成分之一，能通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲[5～7]。研究發(fā)現(xiàn)，槐定堿能通過抑制NF-κB介導(dǎo)的抗凋亡通路及激活Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[12]。另有研究證實(shí)，槐定堿能通過誘導(dǎo)ROS聚集，激活線粒體途徑而發(fā)揮抗腫瘤活性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，槐定堿能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。為了進(jìn)一步探討槐定堿對(duì)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞可能存在的作用機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測(cè)了Wnt/β-catenin 通路中因子的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，槐定堿能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)βcatenin 的表達(dá)，提示槐定堿可能對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活性具有抑制作用。βcatenin 參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲過程的調(diào)控，當(dāng)其表達(dá)被抑制后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲相應(yīng)受到影響[14]。

E-cadherin 是Wnt 信號(hào)通路中一個(gè)重要的因子，其表達(dá)缺失是EMT過程的重要標(biāo)志[9，10]。可以通過恢復(fù)E-cadherin的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲活性[10，15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槐定堿能有效促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 的表達(dá)，我們推測(cè)槐定堿對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的抑制，與抑制細(xì)胞內(nèi)Wnt/βcatenin 活性，同時(shí)刺激E-cadherin 表達(dá)而抑制EMT過程有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，占主導(dǎo)地位的Ecadherin的表達(dá)降低能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞播散，同時(shí)能增加細(xì)胞內(nèi)Vimentin 的活性[9]。Vimentin 主要作用在于調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮、黏附和遷移，是EMT 途徑另一重要的蛋白之一[9，10]。本研究發(fā)現(xiàn)，槐定堿在促進(jìn)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)的同時(shí)，能抑制Vimentin的活性，我們推測(cè)槐定堿可能通過刺激人膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 表達(dá)，抑制Vimentin 的活性，而阻斷細(xì)胞內(nèi)EMT過程，減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

MMP-9為Wnt 信號(hào)通路另一重要下游靶基因，為降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的關(guān)鍵酶，也可以誘導(dǎo)EMT過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，槐定堿能抑制MMP-9的表達(dá)，進(jìn)一步說明槐定堿對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用與其對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路活性的抑制作用密切相關(guān)。

綜上所述，槐定堿能抑制人膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的遷移和侵襲，機(jī)制可能是通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活性，阻斷EMT過程。