劉志峰 陳永漢 姜 浩

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是惡性程度最高的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，目前主要行手術(shù)治療聯(lián)合化療、放療等綜合治療，但因腫瘤呈侵襲性生長(zhǎng)，徹底切除難度大，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后很差。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織多種基因呈異常表達(dá)[1]。研究發(fā)現(xiàn)血管動(dòng)蛋白（angiomotin，AMOT）家族成員可能具有抑癌或致癌作用，類(lèi)血管動(dòng)蛋白-2（angiomotin like-2，AMOTL2）作為該家族的一員，參與腫瘤進(jìn)展[2]。Takaoka 等[3]發(fā)現(xiàn)FK506 結(jié)合蛋白51（FK506 binding proteins 51，F(xiàn)KBP51）可通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA 和ROCK 蛋白，對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)進(jìn)行控制，參與腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移。本文探討AMOTL2、FKBP51 表達(dá)水平與GBM病人預(yù)后的關(guān)系，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 納入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷證實(shí)為GBM；年齡≥18歲；首次就診，之前無(wú)放、化療等；臨床資料完善；簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患其他原發(fā)性腫瘤；因GBM 復(fù)發(fā)入院；患血液系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)等疾??；入院前3個(gè)月內(nèi)有大手術(shù)史；既往有精神障礙、腦血管疾病、腦膜炎等病史。

收集2016 年6 月～2019 年6 月手術(shù)切除的GBM標(biāo)本92例，取同期收治的顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)切除的非腫瘤腦組織48 例為對(duì)照組。兩組基線資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表1）。

表1 GBM組織AMOTL2、FKBP51、P53、EGFR的表達(dá)變化及IDH1突變情況（例）

1.2 檢測(cè)方法 采用免疫組化法分析AMOTL2、FK?BP51 以及異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydroge?nase-1，IDH1）、P53、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達(dá)情況。組織行石蠟包埋，切片厚度為5 μm。60 ℃烘烤30 min，脫蠟至水化，PBS 洗滌3次×3 min。微波爐內(nèi)熱修復(fù)20 min修復(fù)抗原，PBS 洗滌3 次×3 min。3%去離子水孵育15 min，PBS 洗滌3 次×3 min。10%山羊血清室溫反應(yīng)15 min。加一抗，37 ℃反應(yīng)2 h，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3 次×3 min。加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次×3 min。加入辣根過(guò)氧化物酶，37 ℃反應(yīng)15 min，PBS 洗滌3 次×3 min。DAB 顯色后，蘇木素復(fù)染，干燥、透明、封片，顯微鏡下觀察。

免疫組化染色評(píng)分[4]：記錄高倍視野（×200）下陽(yáng)性細(xì)胞，以細(xì)胞膜、胞漿呈棕黃、棕褐色為陽(yáng)性（圖1）。染色強(qiáng)度：陽(yáng)性細(xì)胞占0～5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別計(jì)0、1、2、3、4 分。顯色程度：無(wú)顯色、淡黃、棕黃以及棕褐色分別計(jì)0、1、2、3 分。二者乘積為最終得分，0～2 分為陰性（低表達(dá)），≥3分為陽(yáng)性（高表達(dá)）。IDH1突變蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以所觀察視野內(nèi)可見(jiàn)棕褐色為陽(yáng)性突變。

圖1 免疫組化染色檢測(cè)GBM組織AMOTL2、FK?BP51表達(dá)（SP法，×200）

1.3 隨訪 出院后隨訪2 年，包括微信、電話、門(mén)診隨訪等，記錄無(wú)進(jìn)展生存期（術(shù)后1 d 開(kāi)始至出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)的時(shí)間）、總生存期（術(shù)后1 d 開(kāi)始至死亡的時(shí)間）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件分析；計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性；采用多因素Cox 比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析生存預(yù)后的影響因素；生存曲線分析FKBP51、AMOTL2表達(dá)水平與病人生存期的關(guān)系；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBM 組織AMOTL2、FKBP51、P53、EGFR 的表達(dá)變化及IDH1突變情況GBM組織AMOTL2低表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），F(xiàn)KBP51、P53、EGFR高表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），IDH1突變率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 GBM 組織AMOTL2、FKBP51 表達(dá)水平與P53、EGFR 表達(dá)水平及IDH1突變水平的相關(guān)性GBM 組織AMOTL2 表達(dá)水平與P53、EGFR 表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.05），GBM 組織FKBP51 表達(dá)水平與P53、EGFR 表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)（P＜0.05）。GBM組織AMOTL2、FKBP51 表達(dá)水平與IDH1 突變水平無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 GBM 組織AMOTL2、FKBP51 表達(dá)水平與P53、EGFR 表達(dá)水平及IDH1突變水平的相關(guān)性

2.3 GBM 病人生存時(shí)間的影響因素 多因素Cox 比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑≥5 cm、病程時(shí)間＞30 d、腫瘤未全切除及P53、EGFR、FKBP51高表達(dá)是生存預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），術(shù)后輔助放化療、IDH1 突變、AMOTL2 高表達(dá)是生存預(yù)后的保護(hù)性因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 GBM病人生存時(shí)間影響因素的Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析

2.4 FKBP51、AMOTL2 表達(dá)水平與病人生存期的關(guān)系 生存曲線分析顯示，AMOTL2高表達(dá)組病人無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期較低表達(dá)組均明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），F(xiàn)KBP51高表達(dá)組無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期較低表達(dá)組均明顯縮短（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 生存曲線分析FKBP51、AMOTL2表達(dá)水平與病人生存期的關(guān)系

3 討論

GBM 惡性程度高，目前治療手段有限，預(yù)后尚不理想，臨床需尋求理想標(biāo)記物為改善GBM預(yù)后提供思路。研究發(fā)現(xiàn)，AMOTL2 是泛素特異性蛋白酶9X（ubiquitin-specific protease 9X，USP9X）的靶標(biāo)，而USP9X 與腫瘤發(fā)生有關(guān)，AMOTL2 可能通過(guò)USP9X 的靶向作用參與腫瘤進(jìn)展[5]。另有研究認(rèn)為FKBP51在膠質(zhì)瘤組織內(nèi)大量表達(dá)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）發(fā)揮作用[6]。本文結(jié)果顯示，GBM 組織AMOTL2 呈低表達(dá)，而FKBP51 呈高表達(dá)。Chen 等[7]指出膠質(zhì)瘤級(jí)別越高，AMOTL2表達(dá)下調(diào)越明顯，可調(diào)節(jié)β-catenin 核轉(zhuǎn)位，影響下游靶基因表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤增殖、侵襲。FKBP51是FK506結(jié)合蛋白的成員，能與Beclin-1 結(jié)合，使蛋白相互作用改變，對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響腫瘤進(jìn)展[8]。夏志秀等[9]研究顯示結(jié)直腸癌組織FKBP51 呈明顯高表達(dá)，浸潤(rùn)越深、腫瘤越大的病人，F(xiàn)KBP51 陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。本文結(jié)果顯示GBM 組織AMOTL2、FKBP51 表達(dá)與P53、EGFR 表達(dá)有相關(guān)性。P53 是p53 基因突變后的產(chǎn)物，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用，甚至可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[10]。EGFR是表皮生長(zhǎng)因子家族的重要成員，能將細(xì)胞中的傳導(dǎo)通路激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移[11]。AMOTL2、FKBP51 與P53、EGFR 可能通過(guò)不同途徑調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞增殖。

本文預(yù)后分析顯示，AMOTL2 高表達(dá)、FKBP51低表達(dá)病人無(wú)進(jìn)展生存期、總生存期更高。Russo等[12]發(fā)現(xiàn)FKBP51 可能通過(guò)誘導(dǎo)PDL-1 表達(dá)，形成FKBP51/PDL-1軸，影響GBM的耐藥信號(hào)通路。

總之，GBM 組織AMOTL2 呈低表達(dá)，F(xiàn)KBP51 呈高表達(dá)，二者與病人預(yù)后有關(guān)。