李桂滿張勇劉艷艷姜黎黎伏曉慶田炳均

1昆明市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科650228；2云南省疾病預(yù)防控制中心急性傳染病防制所，昆明650022

李桂滿和張勇對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)

手足口?。℉FMD）是全球廣泛流行的兒童傳染病[1]。2008年中國大陸發(fā)生了大規(guī)模的HFMD流行[2-3]，同年5月2日，HFMD被正式納入我國丙類法定傳染病管理[4]，隨后逐步成立了全國HFMD實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其開展系統(tǒng)性研究。然而，對(duì)云南省曲靖地區(qū)HFMD的研究尤其是病原學(xué)研究鮮少報(bào)道。本研究對(duì)2019年曲靖地區(qū)HFMD的病原學(xué)進(jìn)行分析，為今后曲靖地區(qū)開展防控提供病原學(xué)基礎(chǔ)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2019年云南省曲靖地區(qū)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)、縣及州（市）醫(yī)院臨床診斷為HFMD的門診及住院患兒為研究對(duì)象，病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《手足口病實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（2018年版）》[5]。所有診斷為HFMD的病例均納入研究，并排除臨床診斷為麻疹和風(fēng)疹等其他病例。采集糞便樣本前已經(jīng)過兒童監(jiān)護(hù)人的知情同意，研究符合赫爾辛基宣言。

二、研究方法

收集所有臨床診斷為HFMD患兒的一般資料（包括姓名、年齡、性別、發(fā)病日期、出疹部位、最高體溫、家庭住址、并發(fā)癥和采樣日期等），采集所有就診和住院患兒的糞便樣本。樣本保存于糞便樣本采集保存管 （領(lǐng)因生物科技上海有限公司），置于-20℃環(huán)境中保存。在冷藏條件下送云南省CDC的HFMD實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測(cè)。

三、樣本處理

2019年云南省CDC的HFMD實(shí)驗(yàn)室共收到曲靖地區(qū)HFMD病例的糞便樣本470份，樣本處理嚴(yán)格按《手足口病實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（2018年版）》[5]進(jìn)行，即在50 mL耐氯仿的離心管中加入10 mL磷酸緩沖液（PBS），1 g玻璃珠、1 mL氯仿。在生物安全柜中將每一份糞便樣本取約2 g加入標(biāo)記好的離心管中，擰緊離心管蓋子，用震蕩器劇烈震蕩20 min，在確保離心機(jī)的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機(jī)1 500×g離心20 min。將上清液分別吸入2個(gè)有外螺旋蓋的凍存管中，一管凍存于-20℃作為備份，另一管存于4~8℃以備提取病毒核酸。

四、病毒RNA提取

病毒RNA提取采用江蘇碩世生物科技股份有限公司全自動(dòng)核酸提取儀（型號(hào)：SSNP-2000A）（磁珠法）提取，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取所用樣本為200 mL，RNA提取物為60 μL。

五、RT-PCR和病毒型別鑒定

先用MD91/OL68-1引物[6]對(duì)病毒VP4區(qū)基因進(jìn)行RT-PCR和測(cè)序，編輯后的序列在GenBank進(jìn)行BLAST搜索，確定病毒型別，再用各型病毒的相關(guān)引物[7]擴(kuò)增腸道病毒（EV）VP1區(qū)全序列并測(cè)序。RT-PCR試劑盒為Access Quick RT-PCR（美國Promega公司）。RT-PCR程序?yàn)椋?0℃30 min，95℃15 min；94℃30 s，45℃30 s，68℃50 s，共40個(gè)循環(huán)，最后在68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，并用Sequencher 4.0軟件（美國Gene Codes公司）進(jìn)行編輯、拼接，得到病毒VP1區(qū)基因完整序列。測(cè)序結(jié)果通過腸道病毒在線定型工具 （Enterovirus Genotyping tool Version 0.1）[8]進(jìn)行病毒型別鑒定。

六、病毒遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用Mega5.2軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。進(jìn)化樹用臨位相接法（neighbor-joining method）作成，所用模式為Kimura二參數(shù)置換法 （Kimura 2-parameter substitution model）。用1 000個(gè)pseudoreplicate datasets進(jìn)行進(jìn)化樹boot strap統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

一、病例基本情況

2019年云南省曲靖地區(qū)共有HFMD臨床診斷病例470例，男性289例，女性181例，性別比為1.60∶1；年齡最小5月齡，最大15歲。病例多見于3歲以下非幼托散居兒童，占47.45%（223例），其次為幼托兒童，占37.45%（176例），學(xué)生占15.11%（71例）。

470例HFMD病例均屬于普通型，無重癥病例，主要表現(xiàn)為發(fā)熱，手、足、口、臀等部位出疹，并有咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀。8例體溫超過38.5℃；21例表現(xiàn)為皮疹或皰疹性咽峽炎。HFMD病例全年都有檢出，發(fā)病高峰在5—10月，其中6月為最高峰（圖1），陽性病例共70例，占總病例數(shù)的13.19%。

圖1 2019年曲靖市手足口病發(fā)病時(shí)間分布

二、病原譜構(gòu)成

470份糞便樣本中共檢測(cè)到62株EV毒株，陽性率為13.19%。62株EV毒株中，42株為EV-A組病毒（67.74%），其中柯薩奇病毒A10型（CV-10）21株（33.87%），CV-A4 1株（1.61%），CV-A6 8株（12.90%），CV-A16 12株（19.35%）；9株為EV-B組病毒（14.52%），其中E11和E12各3株（4.84%），E14 1株（1.61%），E30 2株（3.22%）；EV-C組病毒11株，均為脊灰病毒1型疫苗株（PV1，Sabin株），占陽性總數(shù)的17.74%。未檢測(cè)到EV-A71型和EV-D組病毒。

本次研究，62株毒株中共有5株混合病毒株，樣本181-QJ-YN-CHN-2019（以下簡稱181）由E30和PV1（均為疫苗株，下同）混合，254和320由CVA16和PV1混 合，397和405由CV-A10和PV1混合。

三、CV-A6基因特征

2019年共從曲靖地區(qū)HFMD病例中檢測(cè)到8株CV-A6。按文獻(xiàn)[9]下載CV-A6病毒參考株VP1區(qū)序列，進(jìn)行基因進(jìn)化分析，8株CV-A6均為D3a亞型（圖2）。

圖2 2019年曲靖地區(qū)柯薩奇病毒A6型VP1區(qū)基礎(chǔ)進(jìn)化樹

四、CV-A10基因特征

2019年共從曲靖地區(qū)HFMD病例中檢測(cè)到21株CV-A10毒株。按文獻(xiàn)[10]下載CV-A10病毒參考株VP1區(qū)序列，進(jìn)行基因進(jìn)化分析，21株CV-A10分為兩個(gè)不同的進(jìn)化分支，分支1由13株組成，分支2由8株組成，兩個(gè)進(jìn)化分支之間的核苷酸（nt）差異率為7.00%，氨基酸（aa）差異率為7.40%，分支1與原 型株Kowalik（AF081300）的nt差異率為23.10%，aa差異率為7.40%。分支2與原型株Kowalik的nt差 異 率 為23.90%，aa差 異 率 為6.90%?；驑渲袃蓚€(gè)進(jìn)化分支之間的boot strap值為100%，為兩個(gè)不同的基因亞型（圖3）。

圖3 2019年曲靖地區(qū)柯薩奇病毒A10型VP1區(qū)基因進(jìn)化樹

五、CV-A16基因特征

2019年共從曲靖地區(qū)HFMD病例中檢測(cè)到12株CV-A16毒株，按文獻(xiàn)[11]下載CV-A16病毒VP1區(qū)參考株序列，構(gòu)建基因進(jìn)化樹，12株CV-A16屬于兩個(gè)基因亞型（B1a和B1b），B1a亞型由4株組成，B1b亞型由8株組成，兩組之間的nt差異率為12.00%，aa差異率為1.70%，B1a亞型與原型株G-10（U05876）之間的nt差異率為24.40%，aa差異率為8.00%，B1b亞型與原型株G-10之間的nt差異率為24.90%，aa差異率為8.60%，B1a亞型與B1b亞型之間的boot strap值為97%～99%（圖4）。

圖4 2019年曲靖地區(qū)柯薩奇病毒A16型VP1區(qū)基因進(jìn)化樹

討 論

本文對(duì)云南省曲靖地區(qū)2019年HFMD的病原學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)主要病原是CV-A10，其次是CV-A16和CV-A6。

最近幾年，由CV-A6和CV-A10引起的HFMD散發(fā)和暴發(fā)事件日益增加。2012年印度的研究表明，CV-A16和CV-A6是HFMD的主要病原體[12]。陳煒等[13]發(fā)現(xiàn)2011—2013年福建省HFMD病原譜發(fā)生較大變化，CV-A6成為福建省主要病原之一。張萌等[14]研究顯示，2017—2018年，引起北京及其周邊地區(qū)兒童HFMD的主要病原體是CV-A16，EV-A71的檢出率已顯著下降。以上研究均表明，HFMD的病原譜已經(jīng)發(fā)生改變，主要病原已從EV-A71變?yōu)镃V-A6、CV-A10和CV-A16。Song等[9]對(duì)1992—2015年中國520條和基因庫下載的287條CV-A6病毒VP1區(qū)基因進(jìn)行了進(jìn)化分析，把CV-A6分為A、B、C、D四個(gè)基因型，D基因型又被分為D3a和D3b兩個(gè)亞型。本文在曲靖市共發(fā)現(xiàn)8株CV-A6毒株，占陽性數(shù)的12.90%，基因進(jìn)化分析表明它們都屬于D3a亞型，與Song等[9]的結(jié)果一致。

Ji等[15]對(duì)2009—2016年中國27個(gè)省164條CV-A10代表株和117條從GenBank下載的CV-A10病毒VP1區(qū)完整序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示C2亞型是自2012年以來中國主要的流行亞型。本次曲靖地區(qū)CV-A10進(jìn)化分析表明，21株病毒全為C2基因亞型，并分為2個(gè)進(jìn)化分支，說明C2基因的兩個(gè)進(jìn)化分支同時(shí)在該地區(qū)流行。

Zhang等[11]對(duì)2007—2008年分離自山東、甘肅、內(nèi)蒙古和青海的42株，1999年和2005年分離自北京和廣東的24株以及從GenBank下載的35株共101株CV-A16病毒的VP1區(qū)基因進(jìn)行的遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，1999—2008年所有中國分離株都屬于B1a和B1b亞型，這兩個(gè)亞型是中國的主要流行分支。本次曲靖地區(qū)CV-A16進(jìn)化分析結(jié)果顯示，2019年12株病毒全為B1亞型，B1a（4株）和B1b（8株）兩個(gè)進(jìn)化分支同時(shí)在該地區(qū)流行。

云南省HFMD實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)中，每年各地州都用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。本研究先用MD91/OL68-1引物擴(kuò)增病毒VP4區(qū)基因并定型，再用各組病毒特異性引物擴(kuò)增VP1區(qū)基因用于基因特征分析。MD91/OL68-1引物幾乎能夠擴(kuò)增所有EV[6]，但EV基因VP4區(qū)只有207 bp，能夠定型但不適用于進(jìn)化樹分析，而VP1區(qū)全序測(cè)定是EV基因進(jìn)化分析最可靠的手段。VP4區(qū)和VP1區(qū)的結(jié)合使用是EV測(cè)序定型和基因進(jìn)化分析行之有效的方法，值得全國推廣使用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突