◎ 張曉莉，孫 晶，湯苗苗，師敬敬，李芳芳，辛 瑩

（河南廣電計量檢測有限公司，河南 鄭州 450001）

噁唑菌酮是一種新型高效、廣譜的殺菌劑．屬于線粒體呼吸抑制劑，能中止細胞的氧化磷酸化作用，從而使細胞失去能量來源而死亡[1]。噁唑菌酮在農(nóng)作物種植的病蟲害防治中應(yīng)用廣泛，同時也容易在土壤、水體、農(nóng)作物中殘留，造成環(huán)境污染并影響食品質(zhì)量安全。殘留的噁唑菌酮可通過食物鏈在畜禽動物組織中富集，對廣大消費者的健康造成威脅[2]。我國《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2019）中規(guī)定，噁唑菌酮在哺乳動物肉類殘留最大限量為0.5 mg·kg-1。

農(nóng)藥殘留對人體的危害影響較大，因此要加強對食品中農(nóng)藥殘留的檢測。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS）定性準確，靈敏度高，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、獸藥殘留領(lǐng)域的定性、定量等確證檢測工作中[3]。目前，僅噁唑菌酮在動物源性產(chǎn)品的檢測方法中未查詢到相關(guān)報道。豬肉作為一種日常消費食品，出于安全性考慮，非常有必要建立一種能應(yīng)用于豬肉中檢測農(nóng)藥殘留的方法。為滿足實際需要，本研究以豬肉為對象，建立一種采用通過式高效凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測豬肉中噁唑菌酮的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀HPLCMS/MS（Xevo TQD，美國Waters公司）；Vortex-2渦旋混合儀（德國IKA公司）；CT14RDⅡ高速冷凍離心機（上海精科天美公司）；分析天平（德國Sartorius公司）；EFAA-DC24RT氮吹濃縮儀（上海安譜公司）；Milli-Q Advantage A10 純水機（美國Merck Millipore公司）。

1.2 材料與試劑

乙腈、甲醇、乙酸銨（色譜純，美國Fisher公司）；固相萃取柱Oasis? PRIME HLB（6 mL，200 mg，Waters公司）；實驗用水為超純水。噁唑菌酮標準品（100 mg·L-1，BePure公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標液配制

用移液槍準確移取1.0 mL噁唑菌酮標準品（100 mg·L-1），用乙腈定容至10 mL，配成濃度為10 mg·L-1的儲備液。用空白基質(zhì)溶液配制成1.0～50 μg·L-1的噁唑菌酮標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 色譜條件

BEH-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流速：0.3 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流動相A為10 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），B為乙腈；洗脫程序：0～1 min，60%A；1～3 min，60%～5%A；3～5 min，5%A；5～5.1 min，5%～60%A；5.1～6 min，60%A。質(zhì)譜條件：電噴霧負離子模式（ESI-），毛細管電壓：2.6 kV；離子源溫度：150 ℃；去溶劑溫度：500 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），檢測條件見表1。

表1 噁唑菌酮多重反應(yīng)監(jiān)測條件表

1.3.3 樣品前處理

豬肉樣品勻漿，稱取5 g（精確至0.001 g）試樣于50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL 1%甲酸乙腈、5 g氯化鈉，渦旋振蕩15 min，超聲提取15 min，冷凍離心后，轉(zhuǎn)移上清液，殘留物用10 mL 1%甲酸乙腈重復(fù)提取。合并兩次上清液，45 ℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，加水定容至2 mL，過PRIME HLB凈化柱，收集全部凈化液。取1 mL凈化，加水定容2 mL，過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究以C18為色譜柱，比較了乙腈、甲醇為流動相，以及添加不同濃度甲酸和乙酸銨溶液對噁唑菌酮分離及響應(yīng)的影響。實驗表明，采用梯度洗脫，以乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動相時，噁唑菌酮分離效果較好，靈敏度高。

質(zhì)譜選用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下進行全掃描，考察了在ESI+和ESI-兩種模式下噁唑菌酮各碎片離子的響應(yīng)值，最終確定定性和定量離子以及相關(guān)儀器條件，見表1。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取條件選擇

乙腈極性大、穿透力強，可減少樣品中脂溶性雜質(zhì)的溶出，常用于農(nóng)藥殘留的分析檢測[4]。本實驗比較了乙腈、1%甲酸乙腈和80%乙腈作為提取溶劑的提取效果，通過在空白豬肉樣品中加入一定量的噁唑菌酮標準溶液，使加標濃度為20 μg·kg-1，比較3種不同提取劑的回收率，其提取效果見圖1。其中1%甲酸乙腈回收率最高，達93.5%，因此選用1%甲酸乙腈作為前處理提取劑。

圖1 3種提取溶劑測定豬肉中噁唑菌酮的回收率圖

2.2.2 凈化條件選擇

豬肉中含有大量的脂肪和磷脂，會對目標物檢測造成干擾，為降低實驗成本，本實驗優(yōu)先選用正己烷進行除脂。樣品經(jīng)1%甲酸乙腈提取后，加正己烷除酯凈化，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)噁唑菌酮回收率低于60%，原因是噁唑菌酮在正己烷中也可以溶解，使樣品在除脂凈化中損失較大，故本實驗考慮其他凈化手段。Oasis? PRIME HLB固相萃取小柱具有獨特的親水-疏水平衡性，其吸附劑為強親水性聚合物，能有效去除脂肪，磷脂等干擾雜質(zhì)[5]。因此本實驗采用該萃取柱進行凈化。由圖2可以看出，經(jīng)Oasis? PRIME HLB固相萃取小柱凈化后，脂肪，磷脂等雜質(zhì)對樣品中噁唑菌酮色譜峰干擾明顯下降，且色譜峰形有很大改善。

圖2 噁唑菌酮經(jīng)Prime萃取柱凈化前后離子流色譜圖對比圖

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）是指在色譜分離時，同時洗脫的物質(zhì)改變了待測組分的離子化效應(yīng)，而對待測組分信號造成的影響和干擾[6]?？赏ㄟ^基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線斜率的比值對目標物的基質(zhì)效應(yīng)進行考察。當(dāng)比值ME＞1時，則為基質(zhì)增強效應(yīng)，比值ME＜1時，則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實驗表明，噁唑菌酮在豬肉中ME為0.856 2，即在豬肉中存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，為減少該效應(yīng)，提高分析結(jié)果準確性，本實驗采用基質(zhì)標準曲線進行定量分析。

2.2.4 方法學(xué)研究

將空白豬肉樣品按1.3.3節(jié)進行前處理，添加不同濃度的噁唑菌酮標準品（1.0～50.0 μg·L-1），采用2.1方法測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應(yīng)峰面積為縱坐標進行線性擬合，繪制基質(zhì)標準曲線。結(jié)果表明，噁唑菌酮在1.0～50 μg·L-1線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2為0.995 0，線性關(guān)系良好?？瞻棕i肉樣品在0.01 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.05 mg·kg-13個加標濃度下，回收率在82%～89%，相對標準偏差（RSD）在0.3%～1.1%，見表2。根據(jù)儀器3倍和10倍信噪比，結(jié)合濃度外推法確定方法檢出限和定量限，最終得出噁唑菌酮的檢出限（LOD）為1.0 μg·kg-1，定量限（LOQ）為3.3 μg·kg-1。

表2 噁唑菌酮在豬肉中添加回收結(jié)果表

3 結(jié)論

以豬肉為研究對象，建立了噁唑菌酮的分析測定方法。樣品經(jīng)1%酸化乙腈提取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后加水混勻，經(jīng)Oasis PRIME HLB柱凈化，HPLCMS/MS分析。該方法前處理操作簡便，靈敏度高，適用于豬肉中噁唑菌酮的檢測和確證，為我國檢測動物源產(chǎn)品中噁唑菌酮的殘留量提供參考。