◎ 龍姜柳，管春成，劉桂瓊，楊 坤

（黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556012）

腌魚(yú)是貴州省黔東南州侗族地區(qū)特色傳統(tǒng)發(fā)酵美食，稻田鯉魚(yú)、草魚(yú)通過(guò)食鹽腌制后，加入醪糟、白酒、生姜、花椒等輔料混合均勻，放入壇內(nèi)密封自然發(fā)酵3個(gè)月以上而成的特色魚(yú)制品[1-3]。因其有助消化、含人工無(wú)法合成的氨基酸和特色風(fēng)味等特點(diǎn)，深受當(dāng)?shù)厝藗兊南矏?ài)。

硝基呋喃類(lèi)藥物是一種廣譜抗生素，對(duì)大多數(shù)真菌和病毒具有較好的殺滅作用，且價(jià)格低廉，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域被廣泛用于治療由大腸桿菌或沙門(mén)氏菌所引發(fā)的疾病[4-6]。因硝基呋喃原藥在動(dòng)物體內(nèi)代謝快，半衰期短，檢測(cè)其原藥不足以反映真實(shí)的殘留情況，因此檢測(cè)其代謝物成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7-14]。

目前，我國(guó)水產(chǎn)品檢測(cè)硝基呋喃代謝物殘留的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[15-16]主要采用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，凈化效果差，有很強(qiáng)的基質(zhì)干擾，在檢測(cè)成分更加復(fù)雜的侗族腌魚(yú)時(shí)目標(biāo)化合物基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。倪楊等[17]采用QuEChERS法凈化，凈化效果優(yōu)于正己烷，但該方法僅在蜂蜜樣品上驗(yàn)證，并未對(duì)魚(yú)等水產(chǎn)品樣品進(jìn)行試驗(yàn)。因此，本文采用QuEChERS法研究建立快速凈化復(fù)雜樣品——侗族腌魚(yú)基質(zhì)中硝基呋喃代謝物的前處理方法，同時(shí)為魚(yú)類(lèi)等水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌魚(yú)樣品：5批次購(gòu)于錦屏縣，3批次購(gòu)于黎平縣，3批次購(gòu)于從江縣，2批次購(gòu)于榕江縣，4批次購(gòu)于凱里市。

呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃妥因（AHD）和呋喃西林（SEM）（100 μg·mL-1，壇墨質(zhì)檢）；4種硝基呋喃代謝物同位素內(nèi)標(biāo)（100 μg·mL-1，壇墨質(zhì)檢）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；2-硝基苯甲醛（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸鉀（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；QuEChERS獸藥提取包和凈化管（日本島津公司），水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4000+型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（配電噴霧離子源（ESI），Analyst1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Agilent 1290型液相色譜儀（配二元高壓泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；ML104電子天平（感量0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器公司）；3-18k型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

剔除魚(yú)頭和刺，取魚(yú)肉切成小塊，充分勻漿，保存于-18 ℃，備用。稱(chēng)取2.00 g樣品于50 mL離心管中，加入0.2 mol·L-1鹽酸溶液10.0 mL，2 000 r·min-1振蕩2 min，加入2-鄰硝基苯甲醛溶液0.10 mL，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)0.10 mL。于60 ℃水浴上加熱2 h，取出樣品冷卻至室溫，加0.3 mol·L-1磷酸鉀溶液1 mL，用2.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.2。加入10.0 mL乙腈溶液，搖勻，加入QuEChERS鹽包，渦旋1 min，于8 000 r·min-1下4 ℃離心5 min。吸取上清液于QuEChERS凈化管中，搖勻，靜置2 min，取上清液1.00 mL于10 mL玻璃瓶中40 ℃氮吹至近干，用1.00 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速為0.30 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，90%A；3.0～4.0 min，50%A；4.1～6.0 min，90%A。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧正離子電離模式（ESI+），去溶劑溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣壓力（CUR）：172 kPa；碰撞氣壓力（CAD）：41 kPa；離子氣1壓 力（GS1）：414 kPa；離 子 氣2壓 力（GS2）：379 kPa；離子噴射電壓（IS）：5 500 V；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式。以子母離子的保留時(shí)間和豐度比定性，以峰面積定量。

1.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

向腌魚(yú)陰性樣品中分別添加濃度為1.00 μg·L-1、2.00 μg·L-1、4.00 μg·L-1、6.00 μg·L-1、10.00 μg·L-1和20.00 μg·L-1的4種硝基呋喃代謝物混合標(biāo)液，按照1.3.1項(xiàng)前處理方法測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液響應(yīng)值與其內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

向腌魚(yú)陰性樣品（樣品未檢出）按方法1.3.1方法處理中分別添加100 μL、300 μL、500 μL質(zhì)量濃度為100 μg·L-1硝基呋喃代謝物混合液（0.005 mg·kg-1、0.015 mg·kg-1和0.025 mg·kg-1濃度水平），平行測(cè)試6次，并計(jì)算檢出限、精密度和回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 衍生時(shí)間和溫度的優(yōu)化

分別在40 ℃、50 ℃和60 ℃環(huán)境下衍生1 h、2 h、3 h、4 h和5 h對(duì)4種硝基呋喃代謝物進(jìn)行衍生對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知，在60 ℃下衍生2 h的平均回收率大于97%，因此選擇在60 ℃下衍生2 h。

圖1 衍生溫度和衍生時(shí)間對(duì)4種硝基呋喃代謝物的影響圖

同時(shí)，分別對(duì)衍生后的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行間隔20 h、44 h、66 h重復(fù)測(cè)試，其檢測(cè)結(jié)果與衍生后馬上測(cè)試值偏差均小于5%，因此，4種硝基呋喃衍生物衍生后穩(wěn)定性效果較好。

2.1.2 衍生劑用量的優(yōu)化

按照1.3.1方法分別選擇用2-鄰硝基苯甲醛0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL和0.40 mL對(duì)4種硝基呋喃代謝物進(jìn)行衍生，結(jié)果見(jiàn)圖2。SEM使用0.30 mL衍生劑峰面積最大，AOZ在0.05 mL衍生劑下峰面積最大，AHD和AMOZ在0.10 mL衍生劑峰面積最大。因此，選擇加入2-鄰硝基苯甲醛0.10 mL衍生劑。

圖2 衍生劑用量對(duì)4種硝基呋喃代謝物的影響圖

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

對(duì)硝基呋喃類(lèi)代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生化處理，得到NP-AOZ、NP-SEM、NP-AHD和NP-AMOZ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)針泵以流動(dòng)注射的方式在電噴霧模式下進(jìn)行母離子和子離子掃描，并優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)條件，以達(dá)到最佳靈敏度。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 4種硝基呋喃代謝物及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)質(zhì)譜參數(shù)表

2.2.2 液相條件優(yōu)化

倪 楊等[17]對(duì)BEH C18、HILIC和HSS T3 3種不同型號(hào)的柱子進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)BEH C18柱對(duì)其分離效果好，高海波等[18]也選用BEH C18柱作為分離柱。因此，本文選用Waters BEH C18柱作為分離柱。

采用乙腈-水、乙腈-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水（含5 mmol·L-1乙酸銨）和乙腈-水（含5 mmol·L-1乙酸銨、0.1%甲酸）流動(dòng)相體系優(yōu)化。在梯度洗脫條件下，采集時(shí)間6 min，流速0.30 mL·min-1，柱溫35 ℃條件下，發(fā)現(xiàn)乙腈-水（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相使目標(biāo)物離子化提高，峰形尖銳。在MRM模式下測(cè)定，侗族腌魚(yú)基質(zhì)中添加2 ng·mL-1的4種硝基呋喃類(lèi)代謝物混合標(biāo)樣的色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 侗族腌魚(yú)基質(zhì)加標(biāo)的4種硝基呋喃代謝物的內(nèi)外標(biāo)多反應(yīng)檢測(cè)色譜圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

基質(zhì)效應(yīng)是分析過(guò)程中由待測(cè)物以外的其他物質(zhì)的存在直接或者間接影響待測(cè)物響應(yīng)，造成嚴(yán)重干擾，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。按“1.4”方法配制腌魚(yú)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液及流動(dòng)相初始溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，按公式（1）計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME）：

式中：K1和K2分別表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率，ME越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小。

4種硝基呋喃代謝物在腌魚(yú)中的基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，硝基呋喃代謝物在腌魚(yú)基質(zhì)中只有呋喃西林代謝物存在較小的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其他3種呋喃代謝物在腌魚(yú)基質(zhì)中不存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)定量，以抵基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

圖4 侗族腌魚(yú)4種硝基呋喃代謝物的基質(zhì)效應(yīng)圖

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

在優(yōu)化的UPLC-MS/MS分析條件下，按照1.3.2中的條件對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測(cè)。4種硝基呋喃代謝物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 81～0.999 97，以定量離子3倍信噪比（S/N=3）得到檢出限（LOD）為0.5～1.0 μg·kg-1，以 定 量 離 子10倍 信 噪 比（S/N=10）得到定量下限（LOQ）2.0～3.0 μg·kg-1，侗族腌魚(yú)4種硝基呋喃代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限表

2.5 回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白侗族腌魚(yú)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收 試 驗(yàn)，加 標(biāo) 量 為0.005 mg·kg-1、0.015 mg·kg-1、0.025 mg·kg-1，平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表3。侗族腌魚(yú)3水平添加回收率為97.48%～106.7%，RSD為1.47%～5.64%。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果表（n=6）

2.6 樣品分析

按上述試驗(yàn)方法對(duì)17批次腌魚(yú)進(jìn)行測(cè)試，均未發(fā)現(xiàn)4種硝基呋喃代謝物殘留量。

3 結(jié)論

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定侗族腌魚(yú)中4種硝基呋喃殘留量，通過(guò)優(yōu)化前處理方法，大大縮短了衍生時(shí)間，為快速檢測(cè)分析提供了可能。本方法操作簡(jiǎn)單，衍生穩(wěn)定性好，無(wú)需固相萃取柱凈化，結(jié)果準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，是一種簡(jiǎn)便、快速和高效的測(cè)定方法，適用于侗族腌魚(yú)產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留量的測(cè)定。