◎ 杜玉蘭，嚴(yán)建剛，毛新亮，吳曉春，柳 嘉，段盛林，李曉敏

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；3.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400）

肝臟是人體功能最多、最復(fù)雜的，也是參與食物代謝最重要的器官，在身體里扮演著去氧化、儲(chǔ)存糖原及合成蛋白質(zhì)、膽汁等作用。肝臟損傷時(shí)會(huì)導(dǎo)致糖耐量降低、蛋白質(zhì)和脂類代謝紊亂、水和電解質(zhì)紊亂、三酰甘油增多、血氨增高及凝血功能障礙等問題[1]，所以肝病一直以來都是危害人類健康的一大殺手。

市場(chǎng)上也研制成功出一些護(hù)肝的保健食品和藥品，不過目前此類產(chǎn)品多數(shù)效果不明顯，或者有毒副作用，存在一定的市場(chǎng)局限性。完美（中國(guó)）有限公司與中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院合作，經(jīng)過多年深入研究開發(fā)出一款具有高蛋白且富含洛伐他丁、原花青素、黃酮類等活性成分的功能米。因此，本研究利用斑馬魚酒精肝損傷模型測(cè)定和比較斑馬魚肝臟脂肪光密度及功能米保肝護(hù)肝作用，明確完美（中國(guó)）有限公司研發(fā)的功能米保肝、護(hù)肝的功效。

斑馬魚是一種脊椎動(dòng)物亞門輻鰭魚綱鯉科的小型魚類，具有飼養(yǎng)方便、繁殖能力強(qiáng)、胚胎透明、能在顯微鏡下進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察等特點(diǎn)，最重要一點(diǎn)是其基因序列與人類基因序列保持高度的相似性[2]，其心血管系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)、肝臟等消化系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)等的發(fā)育機(jī)制和特點(diǎn)都與人類極其相似[3]。斑馬魚也被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）列為繼人和嚙齒類鼠之后的第三大模式生物，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究和藥物篩選中[4-5]。本研究利用1%無(wú)水乙醇斑馬魚酒精肝損傷模型，通過Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚肝臟脂肪光密度、保肝作用，評(píng)價(jià)樣品保肝、護(hù)肝功效。此評(píng)價(jià)方法成本低、耗時(shí)短、簡(jiǎn)單、直觀，對(duì)以后評(píng)價(jià)樣品保肝、護(hù)肝作用有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚，以自然成對(duì)交配方式進(jìn)行繁殖。年齡為受精后5 d，飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS·cm-1；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg·L-1CaCO3），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（浙）2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.2 樣品與試劑

1.2.1 樣品

完美牌幸馥稻（宜甘）樣品（簡(jiǎn)稱RD045-01功能性工程米）：完美牌幸馥稻（宜甘）是以糙米、大豆分離蛋白、葛根提取物、玉米肽、山楂粉、紫薯粉和黑米粉等為主要原料制成的紫色、米形功能米，樣品用粉碎機(jī)打成粉末后用純水配制成50 mg·mL-1母液，搖床上下混勻1 h后，離心取上清用作功效評(píng)價(jià)，用養(yǎng)魚用水按需稀釋。

RU-21安體普解酒片，白色片劑，購(gòu)自Spirit Sciences USA，臨用時(shí)用純水配制成100 mg·mL-1的母液備用，用養(yǎng)魚用水按需稀釋。

1.2.2 試劑

無(wú)水乙醇、甲基纖維素，購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；油紅O，購(gòu)自Sigma；4%多聚甲醛，購(gòu)自鼎國(guó)生物。

1.3 儀器與設(shè)備

SZX7解剖顯微鏡（Olympus）、TK-C1481EC顯微鏡相連的相機(jī)、CP214精密電子天平（Ohaus）。

1.4 動(dòng)物模型的建立

用1%的無(wú)水乙醇處理5 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚30 h，建立斑馬魚酒精性脂肪肝模型。

1.5 RD045-01功能性工程米對(duì)斑馬魚身體狀況的影響

隨機(jī)選取180尾受精后5 d（5 dpf）黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚，用1%的無(wú)水乙醇誘發(fā)斑馬魚酒精性脂肪肝。分別水溶給予RD045-01（功能性工程米）500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1、1 500 μg·mL-1和2 000 μg·mL-1濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（養(yǎng)魚用水處理斑馬魚）和模型對(duì)照組，每孔（實(shí)驗(yàn)組）容量為3 mL。RD045-01（功能性工程米）與無(wú)水乙醇共同處理30 h后，觀察記錄斑馬魚的表型和死亡情況，根據(jù)斑馬魚的毒性反應(yīng)和死亡情況確定RD045-01（功能性工程米）對(duì)酒精性脂肪肝模型斑馬魚身體狀況的影響。

1.6 RD045-01功能性工程米對(duì)斑馬魚酒精性脂肪肝保護(hù)作用

1.6.1 分組及給樣

隨機(jī)選取180尾受精后5 d（5 dpf）黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）30尾斑馬魚，用無(wú)水乙醇誘發(fā)斑馬魚酒精性脂肪肝。分別水溶給予RD045-01功能性工程米222 μg·mL-1、667 μg·mL-1和2 000 μg·mL-1濃度，陽(yáng)性對(duì)照藥“RU21”50 μg·mL-1濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（養(yǎng)魚用水處理斑馬魚）和模型對(duì)照組，每孔（實(shí)驗(yàn)組）容量為3 mL。處理時(shí)間為30 h。

1.6.2 評(píng)價(jià)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用油紅O進(jìn)行染色，染色后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚肝臟脂肪光密度總和（S），并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)價(jià)樣品肝保護(hù)作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean±SE表示，樣品肝保護(hù)作用計(jì)算公式如下：

1.6.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用方差分析和Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05表明具有顯著性差異，p＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RD045-01功能性工程米對(duì)斑馬魚身體狀況的影響

在實(shí)驗(yàn)期間觀察期間斑馬魚的表型狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，無(wú)一尾斑馬魚死亡。說明RD045-01功能性工程米在2 000 μg·mL-1濃度及以下時(shí)，對(duì)酒精性脂肪肝模型斑馬魚未產(chǎn)生任何明顯的毒副作用，也未引起死亡。詳見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)斑馬魚身體狀況的影響表（n=30）

2.2 RD045-01功能性工程米對(duì)無(wú)水乙醇誘發(fā)的斑馬魚酒精性脂肪肝的保護(hù)作用

斑馬魚用油紅O進(jìn)行染色，在解剖顯微鏡下拍照分析，斑馬魚肝組織病理變化情況見圖1。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)斑馬魚肝臟形態(tài)變化影響圖

用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚肝臟脂肪光密度總和（S），并進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義評(píng)價(jià)樣品肝保護(hù)作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean±SE表示。處理數(shù)據(jù)匯總見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)斑馬魚肝臟脂肪光密度總和及保肝護(hù)肝作用對(duì)比表（n=10）

由表2可知，模型對(duì)照組斑馬魚肝臟光密度總和（2 954像素）與正常對(duì)照組（997像素）相比差異性極顯著（p＜0.01），表明模型建立成功；陽(yáng)性對(duì)照藥“RU21”50 μg·mL-1濃度組斑馬魚肝臟光密度總和為2 022像素，與模型對(duì)照組相比差異性極顯著（p＜0.01），其對(duì)斑馬魚保肝護(hù)肝作用為48%，說明“RU21”陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)斑馬魚酒精性脂肪肝有保護(hù)作用；RD045-01功能性工程米222 μg·mL-1、667 μg·mL-1和2 000 μg·mL-1濃度組斑馬魚肝臟光密度總和分別為2 720、2 705和2 179像素，保肝護(hù)肝作用分別為12%、13%和40%，與模型對(duì)照組比較，222 μg·mL-1和667 μg·mL-1濃度組p＞0.05，2 000 μg·mL-1濃度組p＜0.01，表明RD045-01功能性工程米在2 000 μg·mL-1濃度條件下對(duì)斑馬魚酒精性脂肪肝有保護(hù)作用。對(duì)比分析詳見圖2和圖3。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)斑馬魚肝臟光密度總和對(duì)比圖

圖3 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)斑馬魚肝保護(hù)作用對(duì)比圖

3 結(jié)論

本研究中的RD045-01功能性工程米是以糙米、大豆分離蛋白、紫薯粉、黑米粉為主要原料并添加葛根提取物、玉米肽、山楂提取物、紅曲米等功效成分，通過生物耦合擠壓重組技術(shù)制成的營(yíng)養(yǎng)豐富，蒸煮后風(fēng)味、形狀等與普通大米類似的一種工程米。通過斑馬魚實(shí)驗(yàn)證明RD045-01功能性工程米對(duì)無(wú)水乙醇誘發(fā)的斑馬魚酒精性脂肪肝有保護(hù)作用，且呈劑量正相關(guān)性。其作用機(jī)理可能是RD045-01功能性工程米能增強(qiáng)體內(nèi)乙醇代謝，減少肝損傷，恢復(fù)肝活力。