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        超聲輔助乙醇提取金銀花中黃酮化合物研究

        2021-11-06 13:10:46白玲燕
        現(xiàn)代食品 2021年17期
        關(guān)鍵詞:黃酮影響

        ◎ 白玲燕

        (北京可佳食品配料有限公司,北京 100176)

        金銀花又名忍冬、銀花[1],屬忍冬科植物,是一種藥食兩用天然植物,具有清熱解毒、抗菌消炎、疏散風(fēng)熱的功效[2]。金銀花中含有多種黃酮類化合物。木犀草素和忍冬苷等黃酮類化合物是金銀花的主要活性成分之一,具有抗自由基、抗氧化的作用,對(duì)人體的心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用,可以防止動(dòng)脈硬化、降低血脂和膽固醇、改善血管的通透性等,黃酮類化合物含量可以作為綜合分析該類藥材的質(zhì)量指標(biāo)[3]。測(cè)定金銀花中黃酮類化合物的含量對(duì)于金銀花的研究具有重要的意義。目前黃酮類物質(zhì)常見(jiàn)的提取方法有水提、乙醇提、超聲法和酶解醇提法等[4-5]。本文采用超聲波輔助乙醇提取金銀花中的總黃酮,對(duì)其提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到最優(yōu)提取條件,對(duì)金銀花深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供數(shù)據(jù)參考。

        目前黃酮類物質(zhì)提取效率較好方法是超聲輔助提取法。主要是利用超聲波的空化效應(yīng)破壞細(xì)胞膜,促進(jìn)黃酮類化合物的釋放與溶出,并且強(qiáng)化提取過(guò)程傳質(zhì)作用[6]。超聲輔助提取屬于物理提取方法,無(wú)化學(xué)反應(yīng)發(fā)生,最大限度地保存目標(biāo)提取組分的生理活性。超聲輔助提取法具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、提取效率高、節(jié)能環(huán)保、常溫提取不破壞熱敏性活性成分和成本低等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于中草藥有效成分提取。

        1 材料與方法

        1.1 材料與設(shè)備

        金銀花,購(gòu)于福建省寧德旭升綜合農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

        KQ-300VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;L-530型離心機(jī),湖南湘儀儀器有限公司;UV-1750型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司。

        1.2 金銀花總黃酮得率的測(cè)定方法

        以蘆丁對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液,510 nm測(cè)定各濃度標(biāo)樣的吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。精密稱取5 g經(jīng)過(guò)干燥粉碎后一定粉碎粒度的金銀花粉末于錐形瓶中,加入一定量的乙醇溶液,用超聲波清洗器在一定的功率和溫度下超聲一定時(shí)間,之后再將浸提液倒入離心管中,用離心機(jī)在4 000 r·min-1的條件下離心20 min,取一定量的上清液,用相應(yīng)的乙醇溶液稀釋一定倍數(shù),再移取12 mL稀釋液于50 mL容量瓶中,顯色后分別測(cè)定其吸光度值,然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程計(jì)算各樣品中黃酮的含量。金銀花總黃酮的得率按公式計(jì)算:

        式中:X-樣品中黃酮類化合物含量,%;C-依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)液中黃酮濃度,μg·mL-1;m-樣品的質(zhì)量,g;F-稀釋倍數(shù);V-待測(cè)液的總體積,mL。

        1.3 單因素試驗(yàn)

        研究超聲輔助乙醇提取因素對(duì)金銀花總黃酮得率的影響,主要考察金銀花粉碎粒度、乙醇的濃度、提取的次數(shù)、時(shí)間、溫度、料液比以及超聲功率等因素對(duì)黃酮類化合物得率的影響。固定其他因素不變,進(jìn)行單因素試驗(yàn),單因素梯度設(shè)計(jì)如下。粉碎粒度:20目、40目、60目、80目 和100目;乙 醇 濃 度:10%、25%、40%、55%、70%、85%和100%;提取時(shí)間:10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min;提取溫度:20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃;料液比(g·mL-1):1∶10、1∶25、1∶40、1∶55、1∶70和1∶85;超聲功率:120 W、150 W、180 W、210 W、240 W和270 W。

        1.4 金銀花總黃酮提取工藝優(yōu)化

        分析單因素試驗(yàn)結(jié)果并綜合考慮,根據(jù)Box-Benhnken(BBD)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn),對(duì)金銀花中總黃酮提取條件進(jìn)行工藝優(yōu)化和響應(yīng)面分析,以期得到最佳提取工藝參數(shù)。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        采用Design-Expert數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

        從不同單因素試驗(yàn)的曲線圖1~圖6。A是不同粉碎粒度對(duì)金銀花總黃酮得率的影響。

        圖1 粉碎粒度對(duì)金銀花總黃酮得率的影響圖

        圖2 乙醇濃度對(duì)金銀花總黃酮得率的影響圖

        圖3 提取時(shí)間對(duì)金銀花總黃酮得率的影響圖

        圖6 超聲功率比對(duì)金銀花總黃酮得率的影響圖

        圖4 提取溫度對(duì)金銀花總黃酮得率的影響圖

        圖5 提取料液比對(duì)金銀花總黃酮得率的影響圖

        經(jīng)F檢驗(yàn),粉碎粒度對(duì)結(jié)果影響差異顯著(P<0.05)。B是乙醇濃度對(duì)金銀花總黃酮得率的影響。經(jīng)F檢驗(yàn),乙醇濃度對(duì)結(jié)果影響差異極顯著(P<0.05)。C是提取時(shí)間對(duì)金銀花總黃酮得率的影響。經(jīng)F檢驗(yàn),提取時(shí)間對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.05)。D是提取溫度對(duì)金銀花總黃酮得率的影響。經(jīng)F檢驗(yàn),提取溫度對(duì)結(jié)果影響有一定的顯著性,但并不是很明顯。E是料液比對(duì)金銀花總黃酮得率的影響。經(jīng)F檢驗(yàn),料液比對(duì)結(jié)果的影響極顯著(P<0.05)。F是超聲功率對(duì)金銀花總黃酮得率的影響。經(jīng)F檢驗(yàn),超聲功率對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.05)。經(jīng)上單因素分析粉碎粒度、提取溫度對(duì)結(jié)果影響并沒(méi)有特別顯著,其余4個(gè)因素對(duì)結(jié)果有極顯著性影響,故選擇乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、超聲功率4個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

        2.2 超聲波輔助乙醇提取金銀花總黃酮最佳工藝的研究

        2.2.1 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比和超聲功率4個(gè)對(duì)金銀花總黃酮得率影響顯著的因素,對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化,沒(méi)有顯著影響的因素選取為60目粉碎粒度,提取溫度保存70 ℃恒溫。響應(yīng)面試驗(yàn)水平因素如表1所示。

        表1 響應(yīng)面試驗(yàn)水平因素表

        2.2.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

        表2 響應(yīng)面分析結(jié)果及指標(biāo)預(yù)測(cè)表

        續(xù)表2

        2.2.3 數(shù)學(xué)模型建立及顯著性檢驗(yàn)

        采用ANOVA變異系數(shù)分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果,其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示,當(dāng)Prob>F值小于0.05時(shí),該因素才具有顯著性。

        采用Design-Expert處理軟件,構(gòu)建影響因素與總黃酮得率(Y)之間數(shù)學(xué)關(guān)系,得到方程為:

        從表3的結(jié)果可以看出,提取時(shí)間和超聲功率這兩個(gè)因素,其Prob>F值小于0.01(均<0.001),說(shuō)明提取時(shí)間和超聲功率對(duì)黃酮提取的影響極為顯著,相反乙醇濃度、料液比所對(duì)應(yīng)的Prob>F值均大于0.05,表明這兩個(gè)影響不顯著,整體模型的“Prob>F”值小于0.01,表明該擬合模型二次方程為極顯著;失擬項(xiàng)比F值為0.85,不顯著,說(shuō)明試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠,擬合二次方程模擬的比較好,可以比較準(zhǔn)確地應(yīng)用于總黃酮提取得率的預(yù)測(cè);方程相關(guān)系數(shù)R2為0.9以上,預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間相關(guān)性較好,并且其校正決定系數(shù)也是0.9以上,表明充分考慮自變量情況下,該回歸方程擬合程度很高。

        表3 顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表

        2.2.4 總黃酮提取最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

        利用上文擬合的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行最優(yōu)工藝參數(shù)預(yù)測(cè),可得:乙醇濃度為56.64%,提取時(shí)間為40.47 min,料液比為1∶40,超聲功率為150 W,此時(shí)金銀花總黃酮得率最大預(yù)測(cè)值為11.48%。采用預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,考慮實(shí)際操作方便性,將黃酮提取工藝參數(shù)調(diào)整為:乙醇濃度為57%,提取時(shí)間為40 min,料液比為1∶40,提取功率為150 W,結(jié)果得到金銀花總黃酮得率為11.41%,與模型預(yù)測(cè)值的誤差為0.61%,因此可知模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值相近,金銀花總黃酮提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

        2.2.5 提取工藝響應(yīng)面交互試驗(yàn)影響效果

        影響金銀花提取因素之間的交互作用對(duì)總黃酮得率的影響效果如圖7所示。

        圖7 提取因素之間的交互作用對(duì)總黃酮得率的影響圖

        圖a顯示的是在料液比為1∶40,超聲功率為150 W時(shí),乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的交互影響。從圖可知,乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的交互影響情況相似,隨著乙醇濃度增加或提取時(shí)間的延長(zhǎng),總黃酮提取得率先上升后下降。

        圖b所示為,當(dāng)超聲功率150 W、提取40 min時(shí),乙醇濃度和料液比對(duì)總黃酮提取得率的交互影響。由圖可知,當(dāng)提取液乙醇濃度較低、料液比較小時(shí),黃酮提取得率也較小,隨著乙醇濃度、料液比的增加,提取得率提高,但增大到一定程度后,得率會(huì)略有下降,原因可能是提取乙醇濃度過(guò)高時(shí),金銀花中總黃酮的溶解度反而下降,而且超聲時(shí)間延長(zhǎng),可能導(dǎo)致黃酮破壞和降解。因此,當(dāng)乙醇濃度為56.64%、料液比為1∶40時(shí),最有利于金銀花總黃酮得率的增加。

        圖c顯示的是在提取時(shí)間為40 min和料液比為1∶40時(shí),乙醇濃度與超聲功率對(duì)金銀花總黃酮得率的影響。從中可以看出,響應(yīng)值對(duì)乙醇濃度與提取功率的變化較不敏感,響應(yīng)面的坡度較平。在試驗(yàn)范圍內(nèi),金銀花總黃酮的提取得率隨著乙醇濃度、提取功率增大,而呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)。因此,在一定范圍內(nèi),增加乙醇濃度、超聲功率有利于總黃酮得率提升。當(dāng)乙醇濃度為56.64%、提取功率為150 W、提取時(shí)間為40 min、料液比為1∶40時(shí),金銀花總黃酮的得率最大。

        圖d顯示的是在乙醇濃度55%為與超聲功率為150 W時(shí),提取時(shí)間、料液比對(duì)總黃酮提取得率的交互影響。從圖可知,在一定范圍內(nèi),金銀花總黃酮得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而先增后減,隨著料液比的增加而先增后變化不明顯。可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間延長(zhǎng),溶液黃酮可能被降解或者氧化,導(dǎo)致黃酮提取得率降低;料液比的增加,增大了物料與液體的接觸面積,加速了黃酮的溶出。因此,當(dāng)乙醇濃度為56.64%、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為40.47 min、料液比為1∶40時(shí),金銀花總黃酮的提取得率最大。

        圖e顯示的是在乙醇濃度為55%和料液比為1∶40時(shí),提取時(shí)間、超聲功率對(duì)金銀花總黃酮提取得率的交互影響。由圖可知,金銀花總黃酮的得率隨著提取時(shí)間與提取溫度的增加而先增加后減少,可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)破壞黃酮結(jié)構(gòu)或者促進(jìn)其氧化轉(zhuǎn)變。乙醇濃度55%、料液比1∶40、提取功率150 W、提取時(shí)間40.47 min,此條件下金銀花總黃酮的提取得率達(dá)到最大。

        圖f顯示的是在提取時(shí)間40.47 min、乙醇濃度55%時(shí),料液比、超聲功率對(duì)金銀花總黃酮提取得率的交互影響。金銀花總黃酮的提取得率隨著料液比的增加而先增加后減少,隨著提取溫度上升提取得率先增加后緩慢下降。因此,當(dāng)提取時(shí)間為40.47 min、乙醇濃度為55%、料液比為1∶40、超聲功率為150 W時(shí),金銀花總黃酮的提取得率達(dá)到最大,最有利于黃酮的溶出。

        4 結(jié)論

        利用單因素試驗(yàn)分析和響應(yīng)面優(yōu)化,并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證得到金銀花中超聲輔助乙醇提取總黃酮的最優(yōu)工藝為:57%乙醇提取濃度,提取時(shí)間40 min,料液比1∶40,150 W超聲功率,該工藝條件下,金銀花總黃酮提取得率為11.41%,黃酮提取得率比傳統(tǒng)提取方法有較為顯著的提高。本研究為藥食兩用原料金銀花中總黃酮高效提取和應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供參考。

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