趙興鑫，田 梅，何立寧，蘇 青，張云霄、楊曉霞

（1.石家莊市畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測中心 050000；2.石家莊市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊 050000；3. 石家莊市藁城區(qū)畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測站 050000；4. 行唐縣畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測站 050000）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，抗生素殘留和耐藥問題也凸顯出來。中藥是我國的瑰寶，守護了華夏兒女幾千年，具有無殘留、副作用低等優(yōu)點。減少抗生素殘留、耐藥以及副作用問題，中藥是最佳的解決辦法。但在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于獸藥產(chǎn)品質(zhì)量的通報中，時常發(fā)現(xiàn)有關(guān)于中獸藥散劑中非法添加化學(xué)藥物的不合格通報，給禽畜養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的安全隱患和經(jīng)濟損失。

目前中獸藥散劑中非法添加化學(xué)藥物檢測常用的方法主要有顯微鏡檢查法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，這些方法雖然技術(shù)相對成熟，但操作較為復(fù)雜，需要專業(yè)性很強的技術(shù)人員。膠體金免疫層析法是近來年用于快速檢測及診斷的新技術(shù)，適用于現(xiàn)場快速篩查，具有操作簡單、省時省力、結(jié)果直觀等優(yōu)點，更適用于基層檢測快速檢測工作。

本實驗采用膠體金免疫層析法對健胃散、白頭翁散和銀翹解散三種常見的中獸藥散劑進行研究，通過對不同濃度的磺胺類和氟喹諾酮類抗生素藥物的測定，證明該方法的可行性，為相關(guān)快速檢測方法的建立提供參考。

1 儀器和材料

膠體金檢測讀數(shù)儀（深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司），磺胺類、氟喹諾酮類膠體金快速檢測卡（深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司），漩渦混合儀（IKA），離心機（Sigma）。實驗用樣本提取液（深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司），磺胺類混合對照品（磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑混合對照品100μg/mL）、氟喹諾酮類混合對照品（氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星混合對照品100μg/mL）。

2 方法

取樣品1±0.01g，放入50mL離心管中，加入20mL樣本提取液，漩渦混合2min，室溫下4000r/min離心5min。取上清液200μL加入微孔條中，反復(fù)抽吸5次使樣品混勻，插入膠體金免疫層析檢測卡，計時5min后，直接目測結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 基質(zhì)干擾考察

膠體金免疫層析法對樣本的處理是有一定要求的，由于免疫反應(yīng)是一種生物反應(yīng)，最終滴加入檢測卡孔中的液體pH要在一定范圍內(nèi)，一般在5～8之間，否則容易出現(xiàn)假陽性或無效的情況；而中獸藥散劑本身物質(zhì)成分復(fù)雜，又具有較深的顏色，易造成干擾。所以在預(yù)實驗時針對樣本提取液（一定濃度的緩沖體系）和稀釋倍數(shù)做了大量的研究，最終確定了該方法?？梢酝ㄟ^圖片清晰地看到健胃散、白頭翁散、銀翹解散在基質(zhì)狀態(tài)下試紙條顯示明顯的陰性，偶有淡黃色背景，但不影響結(jié)果判斷。

3.2 加標(biāo)實驗

健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散，分別稱取1g，至50mL離心管，取磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)品1～100mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至定量得到濃度為1μg/mL的對照品溶液，取稀釋后的對照品溶液80μL加入已稱好樣品的離心管中心，相當(dāng)于中藥散劑中磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑的含量均為80ng，磺胺類總含量為400ng，同時做陰性對照實驗，按“2”方法處理后，待測液的磺胺類添加物的濃度為20ppb，插入磺胺類膠體金免疫層析檢測卡進行檢測，分別記錄結(jié)果，詳見圖1，各個加標(biāo)樣品檢測結(jié)果均為陽性，表明方法準(zhǔn)確性良好。

圖1 健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散的陰陽性檢測（磺胺類）

健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散，分別稱取1g，至50mL離心管，取氟喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)品1～100mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至定量得到濃度為1μg/mL的對照品溶液，取稀釋后的對照品溶液20μL加入已稱好樣品的離心管中心，相當(dāng)于中藥散劑中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星的含量均為20ng，氟喹諾酮類總含量為80ng，同時做陰性對照實驗，按“2”方法處理后，待測液的氟喹諾酮類添加物的濃度為4ppb，插入氟喹諾酮類膠體金免疫層析檢測卡進行檢測，分別記錄結(jié)果，詳見圖2，各個加標(biāo)樣品檢測結(jié)果均為陽性，表明方法準(zhǔn)確性良好。

圖2 健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散的陰陽性檢測（氟喹諾酮類）

4 討論

根據(jù)實驗結(jié)果來看，健胃散、白頭翁散、銀翹解散三種中獸藥散劑在本實驗方法下檢測未出現(xiàn)假陽性或無效的情況，說明該方法的提取溶劑和稀釋倍數(shù)適合，減少了色素及其他雜質(zhì)的影響。同時，在加入的藥物對照品的樣品中，均有檢出，呈現(xiàn)明顯的陽性結(jié)果，且檢測限均達到痕量級別，更進一步確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此方法的優(yōu)勢十分明顯，各檢測項目的靈敏度可以與其他檢測手段媲美，可以對大量樣本的多個靶標(biāo)物質(zhì)進行提前檢測，初步確定違法行為。膠體金免疫層析法主要優(yōu)勢在于操作簡單、省時省力，相對于傳統(tǒng)方法來說，儀器設(shè)備要求較少，檢測費用較低，結(jié)果直觀，適合基層使用，該方法推廣應(yīng)用空間廣闊。

中獸藥散劑品類眾多，成分復(fù)雜，且在種植及炮制時有差異，而膠體金免疫技術(shù)易受樣本基質(zhì)干擾，例如樣品本身色素較多、ph值過低或過高、相似結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)成分等因素，易出現(xiàn)假陽性或無效情況。為解決此類問題，需要調(diào)配合適的提取溶劑和調(diào)整合適的稀釋倍數(shù)來降低基質(zhì)干擾。本文只針對三種中獸藥散劑和八種化學(xué)藥物進行研究，對于其他中獸藥散劑的非法添加化藥的檢測，需進一步實驗研究。