孫 霈 畢菲菲 郝振凱 索 勛 劉賢勇

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

艾美耳屬球蟲感染造成的雞球蟲病可導致家禽死亡、生長不良和生產(chǎn)性能下降，嚴重危害集約化家禽養(yǎng)殖業(yè)(Blakeetal., 2020)。同時，球蟲病還會增加其他病原的易感性。目前對于球蟲病的控制以在飼料或者飲水中添加預防性抗球蟲藥為主，球蟲病疫苗仍處于輔助角色(Clarketal., 2017)。鹽霉素作為一類聚醚離子載體藥物，因其具有抗球蟲譜廣、作用方式獨特且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，在養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛使用，但在該藥上市4年后，各地相繼報道耐藥蟲株的出現(xiàn)。本文將圍繞鹽霉素藥理藥化特性、作用機制及其抗藥性研究等內(nèi)容展開描述。

1 鹽霉素的藥理藥化性質(zhì)

1.1 藥物理化性質(zhì)

鹽霉素屬于聚醚離子載體類藥物，本類藥物是鏈霉菌屬和其他種真菌的發(fā)酵產(chǎn)物。聚醚離子載體類藥物具有很廣的抗蟲譜，對常見的6種雞艾美耳球蟲都有抗球蟲活性，且該類藥物具有作用方式獨特、耐藥性形成緩慢等優(yōu)勢，是目前廣泛使用的一類抗球蟲藥物，該類藥物包括莫能菌素，馬杜拉霉素、鹽霉素等(Antoszczaketal., 2019；Noacketal., 2019)。鹽霉素(salinomycin)，又名沙利霉素，1968年首次由日本科研株式會社發(fā)現(xiàn)，是一種由白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)ATCC21838菌株發(fā)酵的一元羧酸聚醚類抗生素，1981年，Kishi等人提出鹽霉素全合成法(Antoszczaketal., 2019)。

鹽霉素為白色或淡黃色結(jié)晶性粉末，稍有特殊臭味，難溶于水，易溶于有機溶劑，因此生產(chǎn)上多用其鈉鹽。鹽霉素作為一種廣譜抗球蟲藥，具有代謝快、殘留少的特點，對革蘭染色陽性菌、厭氧菌有效，還有促進畜禽生長的作用，但是該藥安全范圍窄，應該嚴格控制混飼濃度(苑興輝, 2016)。若鹽霉素藥物在飼料中混合不均勻、使用時間過長或者與其他藥物聯(lián)合應用不當均會對機體產(chǎn)生毒性，引起動物采食量下降、體重減輕、共濟失調(diào)等癥狀，因此了解藥物的毒性以及機理對快速診斷與采取適宜的用藥方案具有重要意義(周偉偉等, 2006)。

1.2 藥物作用機理

各類聚醚離子載體類藥物具有相似的作用機制，該類藥物在化學結(jié)構(gòu)上含有許多醚基以及一個一元有機羧酸，具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1)。在溶液中由氫鏈連接形成特殊結(jié)構(gòu)，其中心由于并列的氧原子而帶負電，能夠發(fā)揮捕獲陽離子的“磁阱”作用(Antoszczaketal., 2019)。

圖2 鹽霉素作用的可能機制Fig.2 The possible mechanisms of salinomycinA.鹽霉素對癌細胞作用的可能機制(Zhou et al., 2013)；B.鹽霉素抗球蟲的可能機制(Abbas et al., 2011).A. The possible mechanisms of salinomycin action on cancer cell; B. The possible anticoccidial mechanisms of salinomycin.

圖1 鹽霉素的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of salinomycin

幾種聚醚離子載體類藥物的作用機理不完全相同，其區(qū)別在于藥物空間離子半徑不同，因此對機體內(nèi)不同離子的親和力不同。鹽霉素對鉀離子具有偏好性，其次是鈉離子和銫離子?？缰|(zhì)膜的金屬陽離子梯度對于細胞存活具有重要的作用，保持“鉀內(nèi)鈉外”的動態(tài)平衡與維持膜電位、細胞形狀和幾種重要的細胞途徑正常運轉(zhuǎn)密切相關(Kaushiketal., 2018)。Gupta等在藥物篩選實驗時發(fā)現(xiàn)，鹽霉素能選擇性殺傷乳腺癌的腫瘤干細胞，提示鹽霉素有望成為新型抗腫瘤藥物(Guptaetal., 2009)。在治療癌癥時，鹽霉素能顯著抑制腫瘤細胞的生長、誘導腫瘤細胞凋亡，對多種腫瘤均有明顯的抑制作用(Zhouetal., 2013；黃龍等, 2016)(圖2-A)。在抗球蟲中，鹽霉素作為預防類用藥，對雞球蟲生活周期早期——子孢子入侵細胞后的發(fā)育階段有高度的殺滅作用，對無性生殖的裂殖體有較強的抑制作用，其抗球蟲峰期作用于感染后的第2 d(苑興輝, 2016)。鹽霉素通過與鉀離子形成絡合物，擾亂Na+/K+平衡，改變蟲體內(nèi)pH，導致蟲體內(nèi)滲透壓升高，線粒體損傷，進而使蟲體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)腫脹，能量過多消耗，最終導致蟲體死亡(圖2-B)(Chapmanetal., 2010；Antoszczaketal., 2019)。

2 鹽霉素的使用及耐藥性研究

2.1 鹽霉素在養(yǎng)殖業(yè)中的應用

20世紀40年代，市場上抗球蟲藥的數(shù)量陸續(xù)增加。而在20世紀50年代，聚醚離子載體類藥物就被發(fā)現(xiàn)，1974年，鹽霉素獲得抗球蟲藥專利(D'Alessandroetal., 2015)。鹽霉素于1983年投入市場，由于其廣泛的抗蟲譜，該藥迅速在各地區(qū)推廣。在養(yǎng)雞生產(chǎn)中，常使用其6%或10%的預混劑控制雞球蟲病，雛雞混飼用藥量為1 kg飼料中加60～70 mg，雞用本品的休藥期為5 d，本品禁用于產(chǎn)蛋雞，亦禁止與地美硝唑、泰樂菌素、竹桃霉素、泰妙菌素并用(苑興輝, 2016；田永民, 2019)。

表1 國內(nèi)關于鹽霉素抗藥性流行病學調(diào)查Tab.1 Epidemiological investigation of salinomycin resistance in China

2.2 鹽霉素耐藥性研究

藥物的使用，能夠有效降低養(yǎng)殖業(yè)中因球蟲感染帶來的經(jīng)濟損失，但是隨著藥物的出現(xiàn)，各地區(qū)不斷有耐藥株的報道，這嚴重影響藥物的有效性。因此，了解在各地區(qū)的流行情況以及其耐藥性程度，為養(yǎng)殖業(yè)中正確選擇高效的抗球蟲藥、制定合理的用藥方案提供指導方案。利用測序技術，比較抗藥株和敏感株基因水平及轉(zhuǎn)錄水平的差異，能夠深入挖掘耐藥性產(chǎn)生機制及藥物作用機制等信息，以期為新藥研發(fā)奠定基礎。

2.2.1耐藥株流行病學調(diào)查 20世紀40年代，市場上抗球蟲藥的數(shù)量陸續(xù)增加，聚醚類抗球蟲藥之所以發(fā)展迅速, 其原因之一是球蟲對此類藥物不易產(chǎn)生抗藥性，然而隨著時間的推移和使用量的增大, 球蟲對聚醚類抗生素耐藥的報道越來越多。鹽霉素為產(chǎn)生耐藥性最慢的聚醚離子載體類藥物，但1989年美國學者Jeffers等人首次報道已在田間分離出鹽霉素耐藥株，之后不斷有學者報道該類藥物的耐藥性(Abbasetal., 2011；Chapmanetal., 2015)。我國于1995年首次由汪明等從北京、天津、山東和廣東等地10個用藥史不同的雞場分離的樣品中檢測到7/10的球蟲株對鹽霉素產(chǎn)生不同程度的抗藥性，之后也有不同的學者利用抗藥性指數(shù)，如最適抗球蟲活性百分率(POAA)、病變記分減少率(RLS)、相對卵囊產(chǎn)量(ROP)和抗球蟲指數(shù)(ACI)4項指標綜合判定田間分離蟲株的抗藥性程度(表1)。也有相關學者發(fā)現(xiàn)，由于聚醚離子載體藥物作用機理相似，該類藥物之間易產(chǎn)生交叉耐藥性。Raether等人就發(fā)現(xiàn)田間分離株對馬杜拉霉素、鹽霉素、莫能菌素以及拉沙里菌素有高度的交叉耐藥性(Raetheretal., 1989)。

2.2.2藥物誘導獲得鹽霉素耐藥株：自20世紀50年代以來，通過實驗室藥物誘導球蟲對某種藥物產(chǎn)生耐藥性是獲得抗藥株的方法之一。在實驗室條件下，利用藥物梯度遞增誘導策略，即在低濃度條件下對敏感株進行誘導，待穩(wěn)定后逐步提供藥物濃度，經(jīng)多次傳代獲得對藥物推薦濃度(甚至更高濃度藥物)產(chǎn)生耐藥的蟲株。據(jù)報道，不同學者已利用該策略獲得不同藥物的耐藥蟲株。鹽霉素是一類耐藥性產(chǎn)生極為緩慢的抗球蟲藥，王海霞等人以15 mg/kg為起始誘導濃度，經(jīng)過連續(xù)10代誘導，最終獲得對鹽霉素工作濃度(60 mg/kg)抗藥的球蟲蟲株(王海霞等, 2019)。

2.2.3鹽霉素耐藥機制研究現(xiàn)狀：關于艾美耳球蟲針對抗球蟲藥的耐藥機制研究源于用遺傳學方法推測的氟腺呤(arprinocid)耐藥性相關機制(Shirleyetal., 2000)。時至今日，針對藥物抗性機制的研究，球蟲領域的相關研究多停留在比較耐藥株與敏感株耐藥指數(shù)、微觀結(jié)構(gòu)以及利用組學等技術研究蛋白質(zhì)表達水平上的差異(Thabetetal., 2017)。目前，球蟲領域?qū)勖央x子載體類藥物抗藥性的研究，大多學者多針對莫能菌素的耐藥性進行探討，而對于鹽霉素多研究其抗性蟲株的流行情況等內(nèi)容。

馬立農(nóng)等(2010)通過比較耐藥株與敏感株細胞膜流動性，認為球蟲子孢子膜流動性降低可能是鹽霉素失去抗球蟲效果的直接原因。王海霞等(2020)人利用透射電子顯微鏡觀察到耐藥株的子孢子形態(tài)較之敏感株的出現(xiàn)腫脹且細胞膜不光滑，內(nèi)外膜邊界不清晰，微線體減少，細胞核形態(tài)不規(guī)則甚至溶解，部分細胞器結(jié)構(gòu)不明顯。耐藥株與敏感株超微結(jié)構(gòu)的研究為柔嫩艾美耳球蟲球蟲對鹽霉素產(chǎn)生耐藥的機制提供了基礎。

挖掘鹽霉素抗藥性位點，深入解析抗性機制，需要從全基因角度出發(fā)，研究抗性相關基因以及基因表達水平。隨著高通量測序技術的迅速發(fā)展，頂復門原蟲中瘧原蟲領域相繼解析喹啉、常山酮、青蒿素等藥物作用位點，并利用基因編輯技術從分子層面闡明抗性機制，這為球蟲領域研究藥物抗性機理提供方向。轉(zhuǎn)錄組學的研究能從整體水平研究耐藥株及敏感株基因表達差異，以揭示特殊生物學過程。2020年王海霞等通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)敏感株與耐藥株子孢子相比，有17個基因表達上調(diào)以及13個基因表達下調(diào)，其中α淀粉酶(ETH_00004695)以及ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ETH_00012930)基因在耐藥株中表達上調(diào)，轉(zhuǎn)座子Tf28多聚蛋白(ETH_00031285)表達下調(diào)(王海霞, 2020)?？剐曰虻耐诰蚴俏覀兘馕隹剐詸C制以及研發(fā)新藥的基礎，由于基因組測序分析的成本大大降低，基于實驗性進化結(jié)合高通量基因組測序和分析而衍生出進化和重測序技術，作為研究表型和基因型之間對應關系的強大工具，已成為研究遺傳和進化的一大利器。聚醚離子載體類藥物作為一類抗生素藥，對抗革蘭氏陰性菌以及癌癥方面都有重要的作用。在糞腸球菌的抗藥性研究中，利用比較基因組學比較耐藥株和敏感株，發(fā)現(xiàn)基因上存在5.9 kb區(qū)域的差異，該區(qū)域包括兩個編碼ABC型轉(zhuǎn)運蛋白的基因，分別是“ABC轉(zhuǎn)運蛋白滲透酶蛋白”和“ABC型多藥轉(zhuǎn)運系統(tǒng)ATPase組分”(Nilssonetal., 2016)。在癌癥方面的研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)使用鹽霉素作用于細胞，會使細胞產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性，使ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達的上調(diào)，外排泵的上調(diào)減少了細胞內(nèi)藥物的積累并增加了耐藥性(Hermawanetal., 2016)。

3 展望

鹽霉素作為一類抗球蟲藥，其耐藥性的問題會明顯降低該藥的抗球蟲效率。因此，球蟲耐藥性的研究應該更多涉及分子層面以及機制的探討，這是球蟲領域相對空白的地方。利用現(xiàn)代生物信息學技術闡明鹽霉素的作用機理，解釋該藥產(chǎn)生耐藥性機制，挖掘藥物作用靶點，能夠彌補現(xiàn)在球蟲耐藥性領域研究的空白，也將為之后研發(fā)新的抗球蟲藥奠定基礎。