李 潔 王 倩,2 夏珞媛,2 潘育生 賈 娜** 曹務(wù)春**

(1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071；2.山東大學公共衛(wèi)生學院，濟南 250000)

蜱類能夠傳播細菌、病毒、立克次體等病原體(Firthetal., 2014; Chengetal., 2016; Diuk-Wasseretal., 2016; Leeetal., 2016)，是人類和動物疾病的重要傳播媒介(Dantas-Torresetal., 2012)。位于我國西南地區(qū)的云南、貴州省和重慶市是重要的蟲媒疾病疫源地之一，其適宜的氣候和獨特的地形特征適合蜱類生長繁殖，比如硬蜱屬Ixodes、花蜱屬Amblyomma、血蜱屬Haemaphysalis、扇頭蜱屬Rhipicephalus、璃眼蜱屬Hyalomma和革蜱屬Dermacentor等(Wuetal., 2018)。黑龍江和吉林省位于東北地區(qū)，該地區(qū)野生動物植物資源豐富也是蜱媒傳染病的重要自然疫源地之一，常見主要蜱種有全溝硬蜱Ixodespersulcatus、森林革蜱Dermacentorsilvarum、日本血蜱Haemaphysalisjaponica、嗜群血蜱Hae.concinna等(Yuetal., 2015)。廣西省位于華南地區(qū)，氣候類型多樣、雨熱資源豐富，為山地丘陵性盆地地貌，孳生蜱類繁多，嗜龜花蜱Amblyommageoemydae、龜形花蜱Am.testudinarium等少見蜱種分布其中(Jongejan and Uilenberg,2004; de la Fuenteetal., 2017)。這些蜱類及其可能攜帶的病原體監(jiān)測是開展該地區(qū)蜱媒疾病防控的重要基礎(chǔ)。

楚病毒(chuvirus)屬于楚病毒目(Chuviridae)楚病毒科(Chuviridae)，楚病毒科病毒可感染多種無脊椎動物宿主，包括甲殼類、線蟲綱、昆蟲綱、多足綱、蛛形綱和伊克蟲綱(Niuetal., 2020)。隨著宏轉(zhuǎn)錄組學的發(fā)展，學者在湖北武漢的微小扇頭蜱中首次發(fā)現(xiàn)了Wuhan Tick virus 2 ，(WHTV2)(Lietal., 2015)。此后有研究表明，在法國(Gondardetal., 2020)、巴西(Maruyamaetal., 2014)、特立尼達和多巴哥(Sameroffetal., 2019)、泰國(Temmametal., 2019)的微小扇頭蜱中均檢測出此病毒。本研究采集了我國西南西區(qū)、東北地區(qū)、華南地區(qū)的不同蜱種，根據(jù)我們獲得的MIV-2全基因組序列，發(fā)現(xiàn)其與目前發(fā)現(xiàn)的Wuhan Tick virus 2的同源性為94%，MIV-2與WHTV2是同一類病毒的不同株，利用前期建立的MIV-2特異性檢測的熒光定量PCR檢測方法(李潔,2020)，開展了MIV-2流行率的調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2017—2019年，采用布旗法采集我國廣西、云南、遼寧、貴州、黑龍江、吉林省和重慶市活躍季節(jié)游離蜱(圖1)。所有蜱均經(jīng)形態(tài)學鑒定到物種水平，編號后于-80 ℃保存。

圖1 蜱標本采集點分布Fig. 1 Distribution of collection points for tick specimens

1.2 主要試劑和儀器

實驗試劑：All Prep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen)、One Step Prime ScriptTMRT-PCR Kit(大連寶生物工程)、RNase I(Thermo Fisher)、無菌去離子水(索來寶)、無水乙醇(振譽生物科技有限公司)等。實驗儀器：超凈工作臺(NUAIRE)、Light Cycler 480Ⅱ(Roche)、微量移液器(Eppendorf)、渦旋振蕩器(Bencmark)、體式顯微鏡(Leica)、組織研磨儀(上海凈信)、離心機(SIGMA)、恒溫水浴箱(長風)和研缽(上海化科實驗器材公司)等。

1.3 樣品處理及核酸提取

蜱樣品：將研缽高壓消毒烘干，然后用液氮進行預冷，將蜱從人工氣候箱或-80 ℃冰箱中取出放入研缽后于冰盒中快速研磨，研磨4次，后常溫放置大約5 min，以防止加裂解液后凍住；將蜱研磨成勻漿為止。核酸提取按照Qiagen DNA/RNA提取試劑盒的說明書進行。

1.4 病毒篩查

MIV-2為環(huán)狀，包含4個開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)的病毒。通過前期針對其中的病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)建立的檢測方法合成引物(李潔, 2020)，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列、擴增片段長度詳見表1。采用一步法逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR進行試驗。將拷貝數(shù)最低且穩(wěn)定的Ct值定為檢測閾值。本實驗檢測閾值定于Ct<35(100拷貝數(shù)/μL)。在不同房間進行反應體系的配置與PCR擴增，以防污染。

表1 病毒實時熒光定量 PCR引物信息Tab.1 Primers for virus detection with RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 標本篩查結(jié)果

結(jié)果共采到614只蜱蟲(表2)，涉及15個蜱種，所有蜱蟲全部是游離成蜱，對全部蜱蟲進行核酸提取后進行MIV-2檢測，檢出攜帶MIV-2的陽性樣本67個，總陽性率為10.91%，部分結(jié)果見圖2。

表2 蜱標本基本信息Tab.2 Basic information of tick specimen

2.1.1不同地域蜱攜帶MIV-2情況：各省市檢測陽性率從高到低依次為云南、遼寧、貴州、重慶、廣西、吉林、黑龍江。其中MIV-2在云南和遼寧陽性率均為20%以上，說明蜱中攜帶的MIV-2在這兩個省占優(yōu)勢(表3)。

2.1.2不同蜱種攜帶MIV-2情況：本研究共檢測蜱種15個，分別是粒形硬蜱I.granulates、微小扇頭蜱Rh.microplus、卵形硬蜱I.ovatus、龜形花蜱Am.testudinarium、猛突血蜱Hae.montgomeryi、長角血蜱Hae.longicornis、嗜群血蜱Hae.concinna、森林革蜱D.silvarum、日本血蜱Hae.japonica、全溝硬蜱I.persulcatus、爪哇花蜱Am.javaense、嗜龜花蜱Am.geoemydae、鐮形扇頭蜱R.haemaphysaloides、草原革蜱D.nuttalli、豪豬血蜱Hae.hystricis，在粒形硬蜱、微小扇頭蜱、卵形硬蜱、龜形花蜱、猛突血蜱、長角血蜱、嗜群血蜱、森林革蜱8種蜱種中檢測到MIV-2。證實MIV-2可以由多蜱種攜帶，由于樣本量有限，雖然并未在日本血蜱、全溝硬蜱、爪哇花蜱、嗜龜花蜱、鐮形扇頭蜱、草原革蜱、豪豬血蜱中檢測到MIV-2，但并不排除其攜帶MIV-2(表4)的可能性。

表3 不同地域蜱攜帶MIV-2 陽性率結(jié)果Tab.3 The positive rate of ticks carrying MIV-2 in different regions

圖2 部分實時熒光定量 PCR結(jié)果Fig. 2 Part results of RT-qPCR A：陽性結(jié)果；B：陰性結(jié)果。A: The positive result; B: The negative result.紅色: 陽性結(jié)果；綠色：陰性結(jié)果。Red: The positive result; Green: The negative result.

表4 不同蜱種攜帶MIV-2感染率結(jié)果Tab.4 Infection rate of tick species infected by MIV-2

3 討論

蜱是人類和動物病毒的重要媒介，目前研究發(fā)現(xiàn)160余種病毒是由蜱傳播的，約25%的蜱傳病毒與疾病有關(guān)(Kazimírovetal., 2017)。在我國能導致嚴重疾病的蜱傳病毒主要有非洲豬瘟病毒(African swine fever virus ，ASFV)、蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)、克里米亞—剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)以及原發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)(Yuetal., 2015)。然而，目前對蜱傳病毒多樣性的了解十分有限(Tokarzetal., 2014, 2018)。本研究采集了我國7個省、市、15個蜱種，其中黑龍江采集的硬蜱屬、血蜱屬標本數(shù)量較多，這與趙國平等人的地理預測研究一致(趙國平,2018)，本研究蜱類標本來源廣泛，蜱種較為豐富，對蜱傳病毒的媒介和傳播研究有一定指導意義。

楚病毒(chuvirus)屬于楚病毒科(Chuviridae)荊楚病毒目(Jingchuvirales)，可能是至今發(fā)現(xiàn)的第1個可以自主復制環(huán)狀RNA病毒，有研究表明，節(jié)肢動物中攜帶此類病毒，其致病性仍不清楚(Wangetal., 2019)。MIV-2屬于chuvirus，為環(huán)狀RNA病毒，近年來在世界多地中發(fā)現(xiàn)同類楚病毒(Lietal., 2015; Gondardetal., 2020)，但其媒介、宿主和致病性研究仍較缺乏。為此，本研究以一步法逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測結(jié)果為依據(jù)，對我國云南、貴州、遼寧、黑龍江、吉林、廣西和重慶的蜱類標本攜帶的MIV-2情況進行了調(diào)查，樣本總陽性率為10.91%，其中，MIV-2在云南和遼寧陽性率較高，分別為30.00%和20.83%。本研究共檢測蜱種15種，在粒形硬蜱、微小扇頭蜱、卵形硬蜱、龜形花蜱、猛突血蜱、長角血蜱、嗜群血蜱、森林革蜱中均檢測到MIV-2，張永振等亦發(fā)現(xiàn)微小扇頭蜱中WHTV2的存在(Lietal., 2015)，MIV-2與WHTV2是同一類病毒的不同株，可見，MIV-2可感染多個蜱種，至于這些是否具備傳播楚病毒的能力以及這些楚病毒對人類致病性仍需進一步研究。

鑒于相同的叮咬吸血特征，多種蜱類具有復合感染多種病原體的潛能，因而，攜帶MIV-2的蜱種也可能同時可攜帶其他致病病原體，如伯氏疏螺旋體、無形體，立克次體、SFTSV等(周明浩等, 2019)，這些病原體的感染是否與MIV-2相關(guān)還有待進一步研究。MIV-2在這些蜱種中自然感染的發(fā)現(xiàn)對于探討相關(guān)蜱媒疾病發(fā)生和預防具有重要理論和現(xiàn)實意義。