王桂玲，冉 皚，吳勝昔，谷志鵬，黃 蕾，龔呂鴻

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)又稱(chēng)“癌中之王”，是一種常見(jiàn)且致死率極高的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤死亡率中高居第三，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康和生命[1]。我國(guó)每年約39萬(wàn)人罹患肝癌死亡，數(shù)量超過(guò)全球肝癌死亡人數(shù)的一半。肝癌侵襲力強(qiáng)，經(jīng)手術(shù)切除、肝移植后，患者5年的生存率僅為70%，加上肝癌的預(yù)后較差，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高，因此HCC的早期診斷意義重大[2]。

人甲胎蛋白(alpha-Fetoprotein，AFP)是1個(gè)分子量約為70 kDa的糖蛋白，含有591個(gè)氨基酸，屬白蛋白家族，源于胚胎內(nèi)胚層組織細(xì)胞，主要由胎兒肝細(xì)胞及卵黃囊合成[3]。當(dāng)胎兒發(fā)育至12～16周時(shí)，可在胎兒的血液循環(huán)中檢測(cè)到高達(dá)3 g/L的AFP，妊娠30周達(dá)到最高峰，之后逐漸下降。胎兒出生2～3月后，隨著干細(xì)胞表達(dá)下降，體內(nèi)的AFP轉(zhuǎn)變?yōu)榘椎鞍浊以谘逯兄荒軝z測(cè)到微量的AFP蛋白，出生后的第二年接近成人水平，正常人血清中AFP的含量會(huì)維持在1個(gè)較低水平(<20 μg/L)[4-6]。1964年，前蘇聯(lián)專(zhuān)家Wong等[7]在肝癌患者血清中首次發(fā)現(xiàn)AFP，截至目前，AFP被認(rèn)為是肝癌診斷的最佳生物標(biāo)志物。肝癌患者表現(xiàn)出臨床癥狀的前8個(gè)月時(shí)，血清中AFP的含量已經(jīng)顯著升高，因此AFP在臨床上廣泛用于原發(fā)性肝癌的診斷及療效監(jiān)測(cè)。AFP具有很多重要的生理功能，如運(yùn)輸功能、免疫抑制、T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡、作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的雙向調(diào)節(jié)功能等[8]。血清中AFP濃度的異常增高與多種惡性疾病的發(fā)展有密切關(guān)系，血清中AFP>400 μg/L并持續(xù)一個(gè)月以上則提示肝癌高風(fēng)險(xiǎn)。AFP可用于評(píng)估肝癌的預(yù)后性，濃度升高則提示預(yù)后不良。此外，AFP還可用于肝癌高危人群的篩查[9]，乙型肝炎性或丙型肝炎性、肝硬化患者每6個(gè)月進(jìn)行一次血清AFP的跟蹤隨訪和腹部超聲。目前，肝癌血清標(biāo)志物AFP的檢測(cè)方法主要以抗原抗體發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，然而國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的AFP檢測(cè)試劑的質(zhì)量不一，國(guó)外進(jìn)口價(jià)格昂貴。因此，制備純度高、特異性強(qiáng)、成本較低的AFP蛋白可為肝癌的早期快速檢測(cè)提供有效試劑。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于上海唯地生物科技有限公司；pET28a(+)質(zhì)粒載體由重慶理工大學(xué)基因工程實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予；pET28a(+)-AFP質(zhì)粒、pET28a(+)-AFP/DH5α甘油菌是由蘇州金唯智生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 主要試劑及儀器

DNA Marker、QuickCut NdeI、QuickCut XholI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa；小型質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；6×Loading Buffer購(gòu)自北京金克隆生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司；卡那霉素和IPTG分別購(gòu)自賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司和美國(guó)Genview公司；5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自biosharp公司；HRP-羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NGC蛋白純化系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)(上海)分公司；Nano-300微量核酸蛋白檢測(cè)儀購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司；Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.3 序列分析與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)布的AFP全基因序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001134.2)，對(duì)AFP基因序列分析及大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，在AFP全長(zhǎng)基因序列的C-端及N-端各加一組6×His-Tag，以pET28a(+)作為原核表達(dá)載體。交由蘇州金唯智公司進(jìn)行基因構(gòu)建與合成。

1.4 pET28a(+)-AFP重組質(zhì)粒的酶切與鑒定

用接種環(huán)蘸取少量pET28a(+)-AFP/DH5α甘油菌，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基(含有50 μg/mL卡拉霉素)，37 ℃培養(yǎng)30 min后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單菌落并接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基試管(含50 μg/mL卡拉霉素)，37 ℃，180 rpm，振蕩培養(yǎng)12 h，測(cè)量菌液的OD600值達(dá)0.6～0.8時(shí)，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取。測(cè)定pET28a(+)-AFP重組質(zhì)粒的濃度，確保在下述酶切反應(yīng)體系中質(zhì)粒數(shù)量可達(dá)500～1 000 ng。利用快切酶NdeI、XholI進(jìn)行雙酶切鑒定，反應(yīng)體系如表1所示，37 ℃酶切反應(yīng)30 min。對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，100 V，80 mA，電泳30 min。

表1 pET28a(+)-AFP的雙酶切體系

1.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及重組菌的保存

將重組質(zhì)粒以熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照文獻(xiàn)[10-11]。將轉(zhuǎn)化成功后的pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)進(jìn)行菌種保存，具體操作步驟如下：挑取平板上大而飽滿的單菌落，接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日，將試管中的菌液同30%甘油溶液(經(jīng)高壓滅菌)按1∶1的比例混勻，長(zhǎng)期保存于-80 ℃。

1.6 pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重組蛋白的表達(dá)與鑒定

按上述步驟對(duì)pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重組工程菌進(jìn)行單菌落培養(yǎng)并接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基，待菌液培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，加入適量濃度的IPTG，150 r/min，誘導(dǎo)擴(kuò)增8 h。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液進(jìn)行超聲破碎，10 000 r/min離心2 min，棄上清，將菌體沉淀用適量的滅菌水重懸，取20 μL沉淀懸液與5 μL 5×SDS上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定?？蛰d體按照相同條件處理。

1.7 pET28a(+)-AFP重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件篩選

pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重組工程菌劃線接種并培養(yǎng)至5 mL試管，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液的OD600值達(dá)0.6～0.8時(shí)，將各試管按誘導(dǎo)溫度梯度(16、25、30、37 ℃)、IPTG濃度梯度(0.1、0.3、0.5、0.75、1 mmol/L)及時(shí)間梯度(2、4、6、8、10、12 h)進(jìn)行誘導(dǎo)條件篩選。利用SDS-PAGE電泳對(duì)樣品進(jìn)行鑒定，從而得到AFP重組蛋白大量表達(dá)的最佳誘導(dǎo)表?xiàng)l件。

1.8 pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重組工程菌的擴(kuò)大培養(yǎng)

按照上述步驟擴(kuò)大培養(yǎng)AFP重組基因工程菌后，根據(jù)篩得的最佳誘導(dǎo)條件使菌液大量表達(dá)AFP重組蛋白。

1.9 重組蛋白pET28a(+)-AFP包涵體的處理及純化AFP重組蛋白

1.9.1包涵體處理

按上述步驟對(duì)pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)工程菌進(jìn)行二次活化，以最佳誘導(dǎo)條件大量表達(dá)AFP重組蛋白，10 000 rpm，4 ℃離心10 min后棄上清，向沉淀中加入PBS(1∶30)。10 000 rpm，4 ℃離心10 min后棄上清，向沉淀中加入裂解液(1∶20)和PMSF(1∶100)，超聲破菌，14 000 rpm，4 ℃低溫離心15 min后棄上清并收集包涵體沉淀。向沉淀中加入裂解液(1∶30)，渦旋至沉淀溶解。14 000 rpm，4 ℃離心15 min后棄上清。向沉淀中加入8M尿素(1∶30)，4 ℃低速攪拌15 h。將溶解的產(chǎn)物離心(14 000 rpm，4 ℃離心10 min)并收集上清(包涵體粗提液)。

1.9.2親和層析鎳柱純化AFP重組蛋白

利用NGCTMChromatography System對(duì)pET28a(+)-AFP重組蛋白包涵體進(jìn)行親和層析純化，具體操作步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

1.10 AFP重組蛋白的Western blot鑒定

取20 μL純化后的蛋白樣品與5 μL 5×SDS上樣緩沖液，渦旋儀混勻后置沸水中變性10 min，然后進(jìn)行SDS-PAGR電泳鑒定。按照Western blot步驟[13]對(duì)純化后的蛋白樣品進(jìn)行特異性鑒定。

1.11 AFP重組蛋白樣品的濃度測(cè)定

按照北京鼎國(guó)昌盛BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒的步驟測(cè)定AFP重組蛋白樣品的濃度，具體操作如下：

1) 配制BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液：用滅菌的雙蒸水稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品至0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL；

2)稀釋后的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按照10 μL/孔逐次加到96孔板中，加入10 μL待測(cè)蛋白樣品，每個(gè)樣品做3個(gè)平行組；

3) 將試劑盒中A液和B液按照50∶1的比例配制工作液，200 μL/孔，將96孔板置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min；

4) 提前預(yù)熱MULTISKAN GO分光光度儀，在562 nm下測(cè)得該樣品的OD562值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以測(cè)定AFP重組蛋白的濃度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 酶切鑒定結(jié)果

用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Xhol I對(duì)重組質(zhì)粒pET28a(+)-AFP進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示，在1 875 bp(目的基因)及5 369 bp(空載體pET28a(+))處均出現(xiàn)了核酸電泳條帶，此結(jié)果與預(yù)期相符合，證明pET28a(+)-AFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果表明該克隆序列各連接位點(diǎn)及閱讀框架正確，與預(yù)期相符合。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-2：未酶切質(zhì)粒；3-4：重組質(zhì)粒經(jīng)Nde I、Xhol I雙酶切圖1 重組質(zhì)粒pET28a(+)-AFP的酶切鑒定

2.2 重組蛋白pET28a(+)-AFP的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定

挑取5個(gè)pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)單菌落，以pET28a(+)/BL21(DE3)菌株作對(duì)照，在相同條件下(37 ℃，IPTG濃度為1 mmol/L，150 rpm誘導(dǎo)8 h)誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲破碎和離心，用適量的滅菌水對(duì)菌體沉淀重懸，SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果如圖2所示，5個(gè)AFP重組單菌落在經(jīng)過(guò)相同條件誘導(dǎo)后，在75 kDa處均出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶，pET-28a(+)/BL21(DE3)菌株在此處沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白條帶，未誘導(dǎo)對(duì)照組只是少量表達(dá)，此結(jié)果與預(yù)期計(jì)算的分子量大小一致，說(shuō)明該重組菌可成功表達(dá)AFP重組蛋白。

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-28a(+)/BL21(DE3)空白組；2：1號(hào)菌誘導(dǎo)前；3：1號(hào)菌誘導(dǎo)后4: 2號(hào)菌誘導(dǎo)前；5：2號(hào)菌誘導(dǎo)后；6：3號(hào)菌誘導(dǎo)前；7：3號(hào)菌誘導(dǎo)后；8：4號(hào)菌誘導(dǎo)前；9：4號(hào)菌誘導(dǎo)后；10: 5號(hào)菌誘導(dǎo)前；11：5號(hào)菌誘導(dǎo)后圖2 AFP重組蛋白的鑒定

2.3 pET28a(+)-AFP重組蛋白的最佳誘導(dǎo)條件的篩選

通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)劑IPTG濃度，誘導(dǎo)時(shí)間的篩選，獲得AFP重組蛋白大量表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件：30 ℃，0.1 mM IPTG，誘導(dǎo)8 h。

1) 設(shè)定IPTG濃度為1 mmol/L，在4個(gè)溫度條件(16、25、30、37 ℃)中，150 r/min振蕩誘導(dǎo)6 h。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃，AFP重組蛋白的表達(dá)量更高，故選擇30 ℃為AFP重組蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度。

M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: pET-28a(+)/BL21(DE3)空白組；2: 未誘導(dǎo)對(duì)照；3:16 ℃誘導(dǎo)上清；4: 16 ℃誘導(dǎo)沉淀；5: 25 ℃誘導(dǎo)上清；6: 25 ℃誘導(dǎo)沉淀；7: 30 ℃誘導(dǎo)上清；8: 30 ℃誘導(dǎo)沉淀；9: 37 ℃誘導(dǎo)上清；10: 37 ℃誘導(dǎo)沉淀圖3 重組蛋白AFP的最佳誘導(dǎo)溫度篩選結(jié)果

2) 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30℃，設(shè)定5個(gè)IPTG濃度(0.1、0.3、0.5、0.75、1 mmol/L)，150 r/min振蕩誘導(dǎo)6 h。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmol/L，AFP重組蛋白的表達(dá)量更高，故選擇0.1 mmol/L的IPTG為最佳誘導(dǎo)劑濃度。

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：未誘導(dǎo)對(duì)照；2：0.1 mmoL/L誘導(dǎo)上清；3：0.1 mmoL/L誘導(dǎo)沉淀；4：0.3 mmoL/L誘導(dǎo)上清；5： 0.3 mmoL/L誘導(dǎo)沉淀；6：0.5 mmoL/L誘導(dǎo)上清；7：0.5 mmoL/L誘導(dǎo)沉淀；8：0.75 mmoL/L誘導(dǎo)沉淀.9：0.75 mmoL/L誘導(dǎo)沉淀；10：1 mmoL/L誘導(dǎo)上清;11：1 mmoL/L誘導(dǎo)沉淀圖4 重組蛋白AFP最佳誘導(dǎo)劑濃度篩選結(jié)果

3) 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃，IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)，150 r/min振蕩誘導(dǎo)2、4、6、8、10、12 h。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為8 h或10 h時(shí)，AFP重組蛋白的表達(dá)量較高，綜合確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h。

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：2h誘導(dǎo)上清；2：2 h誘導(dǎo)沉淀；3：4 h誘導(dǎo)上清；4：4h誘導(dǎo)沉淀；5：6 h誘導(dǎo)上清；6：6 h誘導(dǎo)沉淀；7：8 h誘導(dǎo)上清；8：8 h誘導(dǎo)沉淀9：10 h誘導(dǎo)上清；10：10 h誘導(dǎo)沉淀；11：12 h誘導(dǎo)上清12：12 h誘導(dǎo)沉淀圖5 重組蛋白AFP最佳誘導(dǎo)時(shí)間篩選結(jié)果

2.4 AFP重組蛋白的純化

按照最佳誘導(dǎo)條件獲得大量表達(dá)的AFP重組蛋白后，通過(guò)洗滌包涵體、溶解變性、純化及蛋白復(fù)性，獲得AFP重組蛋白。如圖6所示，300 mM的咪唑可將AFP目的蛋白完全洗脫。收集280 nm紫外吸收峰下的AFP重組蛋白樣品并進(jìn)行SDS-PAGE電泳純度鑒定，結(jié)果如圖7所示，純化后的AFP重組蛋白分子量與預(yù)期相符且純度較高。

圖6 NGCTM親和層析系統(tǒng)純化AFP重組蛋白圖譜

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-12：純化后的重組蛋白AFP；13：純化前的樣品圖7 pET28a(+)-AFP重組蛋白純化鑒定

2.5 重組蛋白pET28a(+)-AFP的Western blot鑒定

Western blot結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組(1-2)在75KD處有明顯的蛋白印跡出現(xiàn)(見(jiàn)圖8)，pET28a(+)/BL21(DE3)對(duì)照組(3-4)無(wú)條帶，表明經(jīng)Ni柱純化后制得的AFP重組蛋白特異性良好。

1-2：重組蛋白AFP；3-4：pET-28a(+)/BL21(DE3)空白組圖8 重組蛋白AFP Western blot 鑒定

2.6 重組蛋白AFP的濃度測(cè)定

用BCA法測(cè)定AFP重組蛋白的濃度，結(jié)果如表2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9所示，其中，回歸方程式：y=1.852 6x-0.238 7,R2=0.999 1，線性關(guān)系良好。

表2 pET28a(+)-AFP濃度測(cè)定

圖9 重組蛋白AFP濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)論

1) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分子遺傳結(jié)構(gòu)清楚、操作簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)迅速、適于大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，利用該系統(tǒng)制備AFP重組蛋白具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的優(yōu)勢(shì)。

2) 本研究選擇pET28a(+)作為原核表達(dá)載體，可使AFP目的基因高效表達(dá)。AFP全長(zhǎng)基因序列兩端各加的一組6×His-Tag有助于AFP重組蛋白與Ni柱上的金屬離子螯合，從而實(shí)現(xiàn)雜蛋白的有效分離。

3) 通過(guò)優(yōu)化AFP重組蛋白的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)劑IPTG濃度，最終確定在30 ℃，0.1 mM的IPTG，誘導(dǎo)8 h的條件下，AFP重組蛋白可大量表達(dá)。

4) Ni柱純化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：目的基因兩端的2組6×His-Tag不僅提高了Ni柱純化的效率，且不會(huì)影響AFP蛋白的免疫原性。

5) AFP重組蛋白的Western blot鑒定結(jié)果表明：原核表達(dá)的AFP重組蛋白與市售AFP單抗可發(fā)生強(qiáng)烈的特異性結(jié)合。

6) 本研究制得具有良好生物活性且純度較高、特異性強(qiáng)的AFP重組蛋白，為后續(xù)制備AFP單克隆抗體以及AFP抗原檢測(cè)方法的研究提供了有效試劑。