華德興，曾香連，胡春梅，肖鳳金，趙平森

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 韶關(guān) 512026

乙醛代謝酶編碼基因之一乙醛脫氫酶2(ALDH2)處在人類12號(hào)染色體(12q24)，長(zhǎng)度約44 Kb，有13個(gè)外顯子，其中第12號(hào)外顯子易發(fā)生點(diǎn)突變(SNPrs671)，發(fā)生谷氨酸(Glu)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)。酶活性中心氨基酸發(fā)生突變后，催化能力減弱或喪失。目前已知有二個(gè)等位基因，即有催化活性的野生型ALDH2 G和催化能力失活的變異型ALDH2 A。按基因遺傳規(guī)律在人群中存在3 種基因型，包括有正常催化活性純合子ALDH2 GG，活性下降的雜合子ALDH2 GA，活性喪失的純合子ALDH2 AA。代謝酶催化能力減弱或喪失后，乙醇代謝物乙醛易在體內(nèi)停留和蓄積，引發(fā)肝等組織損傷[1]。此外，ALDH2基因?yàn)殡s合子或純合子人群，發(fā)生心肌梗死服用硝酸甘油后，由于硝酸甘油代謝轉(zhuǎn)化能力減弱，舒張血管活性介質(zhì)一氧化氮(NO)生成受阻，導(dǎo)致臨床療效不佳，甚至在急救關(guān)頭可能危及生命安全[2-3]。因此，本文就廣東省韶關(guān)地區(qū)乙醛代謝酶2基因(ALDH2)情況進(jìn)行調(diào)查，為本地人群臨床應(yīng)用和預(yù)防酒精性相關(guān)性疾病發(fā)生以及硝酸甘油合理使用提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年8 月至2020 年9 月于粵北人民醫(yī)院進(jìn)行ALDH2 基因檢測(cè)的1 117 名無親緣關(guān)系的健康體檢人群，其中男性847名，18～92歲，中位數(shù)43.04 歲；女性270 名，年齡23～71 歲，中位數(shù)33.75歲。

1.2 試劑和儀器 核酸提取或純化試劑由蘇州康潔診斷有限公司生產(chǎn)，硝酸甘油及酒精代謝能力測(cè)定試劑盒由江西諾德醫(yī)療器械有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀TC988由西安天隆科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集和核酸提取 采集受檢者2 mL EDTA-K2抗凝血，按照核酸提取或純化試劑說明書進(jìn)行基因組DNA提取。

1.3.2 基因擴(kuò)增和結(jié)果判讀 參照試劑說明書設(shè)置儀器參數(shù)，每孔加入5 μL 熒光基團(tuán)預(yù)混液，1 μL樣品DNA 提取提出液，和3 種陽性質(zhì)控品(陽性性質(zhì)控A ALDH2 Lys504Lys，陽性性質(zhì)控B ALDH2 Glu504Lys，陽性性質(zhì)控C ALDH2 Glu504Glu)及陰性標(biāo)準(zhǔn)品各1 μL共同分析。儀器運(yùn)行加熱程序如下：步驟一、95℃10 min(激活熒光基團(tuán))；步驟二、95℃15 s(使樣本變性)；60℃40 s(使熒光基團(tuán)與樣本充分結(jié)合)；重復(fù)二、三步驟40次；步驟四室溫冷卻1 min，完成反應(yīng)。FAM通道熒光反應(yīng)曲線上翹，高于基線判斷G基因陽性；VIC通道熒光反應(yīng)曲線上翹，高于基線判斷A基因陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行，Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律分析采用χ2檢驗(yàn)，年齡組之間ALDH2 基因型比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，且將韶關(guān)地區(qū)ALDH2 基因型分布頻率與文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)南方北方漢族人群和中國(guó)北方蒙古族人群的ALDH2 基因型分布頻率相比較，地區(qū)之間的基因突變頻率差異比較采用2×2列表的χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH2 G1510A 基因頻率結(jié)果和Hardy-Weinberg 平衡分析 1 117 名體檢人群基因型GG頻率為58.37%、GA 頻率為37.15%、AA 頻率為4.48%;ALDH2 G 與A 兩種等位基因的頻率分別為0.77 和0.23?；蛐蛿?shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinerg 遺傳平衡分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.39，P>0.05)，按照Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，說明本樣本集具有區(qū)域群體代表性，見表1。

表1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 韶關(guān)地區(qū)不同性別、年齡組人群的ALDH2 rs671 基因分布比較 將本人群分為四個(gè)年齡組，年齡組之間進(jìn)行Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.359，P=0.147)，見表2。又將本人群分為男性組和女性組，不同性別組基因型進(jìn)行Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.19，P=0.275)，見表3。

表2 韶關(guān)地區(qū)不同年齡人群的ALDH2基因型分布情況(例)

表3 韶關(guān)地區(qū)不同性別人群的ALDH2基因型分布情況(例)

2.3 韶關(guān)地區(qū)與其它地區(qū)人群ALDH2基因頻率比較 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道數(shù)據(jù)，本地區(qū)人群ALDH2 基因頻率與中國(guó)南方漢族人群等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與中國(guó)北方漢族人群和北方蒙古族人群等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 韶關(guān)地區(qū)與文獻(xiàn)報(bào)道地區(qū)人群等位基因比較[例(%)]

3 討論

乙醛脫氫酶ALDH2 編碼由517 個(gè)氨基酸組成的多肽，主要表達(dá)于肝臟，也表達(dá)于其他器官，如心臟、腎臟、肌肉和大腦[6]。表達(dá)蛋白被運(yùn)輸?shù)骄€粒體基質(zhì)中，特別是參與肝臟和脂肪組織中的脫氫酶、酯酶和還原酶反應(yīng)[7]。在有毒醛的代謝中起著關(guān)鍵作用[7]。人類基因組研究表明，共有19 種功能性ALDH 基因，表達(dá)和底物作用廣泛，其中ALDH2基因表達(dá)最高，且存在遺傳多態(tài)性[8]。由于ALDH2 是酒精代謝的關(guān)鍵酶，它具有重要的功能單核苷酸具多態(tài)性(SNP)，即rs671-Glu504Lys 變體，與野生型相比，其活性顯著降低。ALDH2rs671snp 由GA、AA、GG 三個(gè)基因型組成。GA 是一個(gè)雜合子突變，也被稱為ALDH2*1/*2(Glu/Lys)；AA 是一種純合子突變，也被稱為ALDH2*2/*2(Lys/Lys)；GG 為正常的等位基因，無突變[9]。GA基因型與野生型GG 相比酶活性只有10%～20%，而AA 基因型則失去了超過96%的酶活性。因此，在飲酒后，GA或AA突變個(gè)體的乙醛濃度分別是野生型的6倍或19倍[10]。如出現(xiàn)皮膚發(fā)生潮紅，肝臟乙醛蓄積增多，及損傷肝細(xì)胞，甚至發(fā)展為終末期肝病或肝癌[11]。

硝酸甘油和三硝酸甘油(NTG)廣泛應(yīng)用于冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)和心衰的治療及應(yīng)急措施[2-3]。其作用機(jī)制為硝酸鹽被代謝產(chǎn)生生物活性代謝物，導(dǎo)致一氧化氮(NO)的釋放，從而導(dǎo)致血管舒張和抑制血小板活性[12]。ALDH2 具有酯酶的活性，可以催化NTG 水解生成l，2-GDN 和NO2-，NO2-繼而轉(zhuǎn)化為N0，發(fā)揮舒張血管的作用。細(xì)胞線粒體內(nèi)ALDH2是低劑量NTG生物活化時(shí)的關(guān)鍵酶[13]。然而，耐受性發(fā)展限制了它們有效性，并能排除對(duì)患者持續(xù)給藥。在ALDH2*1/1 和ALDH2*2 患者中，持續(xù)給予NTG 均產(chǎn)生內(nèi)皮功能障礙和硝酸鹽耐受性[14]。而與ALDH2*1/*1 相比，ALDH2*2 減弱了NTG 反應(yīng)，加重了NTG 耐受性[14]。且醛脫氫酶2 變體ALDH2*2 的存在顯著增加了硝酸甘油的EC(50)[15]。研究表明，ALDH2基因多態(tài)性影響NTG 在人體的藥代動(dòng)力學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)[16]?？傊?，ALDH2基因的突變對(duì)NTG的使用有一定的影響。此外，相關(guān)研究也還證實(shí)，ALDH2 基因多態(tài)性與多種心腦血管及代謝性疾病等的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，如高血壓、冠心病、腦卒中、糖尿病[17-20]。

ALDH2基因突變有明顯的地域和種族差異。東亞人中ALDH2突變者較為普遍，而歐美的白人和黑人中卻未見突變者[21]。中國(guó)最高的頻率出現(xiàn)在東南部閩南和粵東的漢族(客家人和閩南人)，攜帶最高頻率福建長(zhǎng)汀縣客家人達(dá)40.9%，其他漢族人群的等位基因頻率為9%～40%，從東南到西北呈明顯下降趨勢(shì)[21]。漢族人群是高發(fā)人群，蒙古族或維吾爾族等發(fā)生頻率較低[21]。在日本，ALDH2 504Lys的攜帶也有一定的頻率，最高的地區(qū)如千葉島34.1%。LI等[22]根據(jù)地理頻率分布和人口遷徙和流動(dòng)推測(cè)，ALDH2 504Lys攜帶可能為中國(guó)中原地區(qū)漢族遷移至南方攜帶而來，以及遷徙至世界各地。

本研究主要調(diào)查為韶關(guān)地區(qū)常住人群ALDH2 504Lys 基因攜帶情況，并與文獻(xiàn)相比較證實(shí)，本地區(qū)漢族人群與文獻(xiàn)報(bào)道南方地區(qū)基因頻率基本一致，明顯高于北方地區(qū)，高于蒙古族人群，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致[4-5]。且本地區(qū)處在高中度的ALDH2 504Lys攜帶頻率地區(qū)，是需要關(guān)注的突變基因，且又是心腦血管及代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素，開展必要檢測(cè)對(duì)保護(hù)健康有重要意義。