張鴻娟，單 斌，孟雪斐，宋貴波，蘇艷丹*

(1 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，昆明 650032；2 云南省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床研究中心，昆明 650032；3 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，昆明 650032)

細(xì)菌耐藥已嚴(yán)重威脅全球公共健康領(lǐng)域，其中耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)引起的感染形勢(shì)最為嚴(yán)峻。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心對(duì)CRE的定義[1]：滿足以下任意一個(gè)條件的腸桿菌目細(xì)菌即定義為CRE。① 對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者。天然對(duì)亞胺培南敏感性低的細(xì)菌(如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等)，需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結(jié)果。② 產(chǎn)生碳青霉烯酶。不同國(guó)家、地區(qū)、醫(yī)院、人群以及細(xì)菌所產(chǎn)的碳青霉烯酶種類均有差異[2-3]。本研究對(duì)不同部位來(lái)源的CRE進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，探討不同部位來(lái)源的CRE檢出情況及耐藥性，供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌來(lái)源

菌株來(lái)源于2018～2020年本院門診和住院患者送檢的各部位樣本，經(jīng)臨床微生物室進(jìn)行分離、培養(yǎng)，藥敏結(jié)果顯示對(duì)任何一種碳青霉烯類抗菌藥物不敏感，摩根菌屬、變形桿菌屬對(duì)亞胺培南以外的其他碳青霉烯類抗菌藥物亦不敏感，剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株后納入分析。按照不同部位來(lái)源[腦脊液、血液、體液(胸水、腹水、關(guān)節(jié)腔積液等)、尿液、痰液、其他(引流液、膿液、膿腫等)]進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。

1.2 藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)方法包括紙片擴(kuò)散法、自動(dòng)化儀器法和 E-test 法等，結(jié)果判讀參考當(dāng)年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。藥敏結(jié)果為敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)，中介結(jié)果不展示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用WHONET 5.6和SPSS 22.0分析處理結(jié)果，比較采用R×C表卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.4 質(zhì)控菌株

質(zhì)控菌株采用大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、表皮葡萄球菌ATCC 49134、肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌ATCC700323、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎鏈球菌ATCC 49619、糞腸球菌ATCC 29212、屎腸球菌ATCC 35667，每周進(jìn)行一次質(zhì)控。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

2.1.1總體分布

2018～2020年共檢出腸桿菌目細(xì)菌11 389株，2018年3492株、2019年3982株、2020年3915株。檢出CRE 1690株，2018年657株、2019年555株、2020年478株。檢出的CRE占腸桿菌目細(xì)菌的比例為2018年18.81%、2019年13.94%、2020年12.21%。CRE占腸桿菌目細(xì)菌的比例呈逐年下降趨勢(shì)。

2.1.2菌株的構(gòu)成

2018～2020年CRE菌株排名前3位的均是肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌，共檢出肺炎克雷伯菌1452株(占85.92%)、大腸埃希菌94株(占5.56%)、陰溝腸桿菌56株(占3.31%)，黏質(zhì)沙雷菌、弗氏檸檬酸桿菌等偶有檢出。CRE的菌株構(gòu)成見(jiàn)表1。

表1 2018～2020年CRE的構(gòu)成情況

2.1.3不同部位來(lái)源的CRE檢出情況

不同部位來(lái)源的腸桿菌目細(xì)菌的檢出排名前3位的均是肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌。其中，陰溝腸桿菌排名均為第3位，肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌標(biāo)本來(lái)源不同排名有差異。尿液中分離出的大腸埃希菌最多，與其他部位分離的大腸埃希菌相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=123.921，P=0.0001)。不同部位來(lái)源的腸桿菌目細(xì)菌檢出情況見(jiàn)表2。不同部位來(lái)源的腸桿菌目細(xì)菌中CRE的占比不同。其中，腦脊液中CRE的占比最高，連續(xù)3年均超過(guò)30%，且呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；尿液標(biāo)本中CRE的占比最低，低于10%。不同部位來(lái)源的CRE占腸桿菌目細(xì)菌中的比例具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=561.5646，P=0.0001)。見(jiàn)表3。

表2 不同部位來(lái)源的腸桿菌目細(xì)菌檢出情況

表3 不同部位來(lái)源的腸桿菌目細(xì)菌中CRE檢出情況

2.2 藥敏情況

2.2.1碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌藥敏情況

2018～2020年分離出碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌共1452株。碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率均>95%，除對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明、磷霉素、四環(huán)素部分敏感外，對(duì)其他的抗菌藥物幾乎全部耐藥。其中，不同部位來(lái)源分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.8849，P=0.4506)；對(duì)阿米卡星(χ2=34.5387，P=0.0001)、磷霉素(χ2=37.62，P=0.0001)、四環(huán)素(χ2=79.559，P=0.0001)的耐藥率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未發(fā)現(xiàn)對(duì)替加環(huán)素耐藥的菌株。見(jiàn)表4。

表4 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌藥敏情況 %

2.2.2碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌藥敏情況

2018～2020年分離出碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌共94株。其中，腦脊液中未分離出碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌；尿液中分離出的最多，為22株。碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率≥50.0%。痰液中分離出的大腸埃希菌耐藥率最高，為91.7%；尿液中分離出的耐藥率最低，為50.0%。對(duì)復(fù)方新諾明、慶大霉素、阿米卡星、磷霉素部分敏感，不同部位來(lái)源分離出的菌株對(duì)復(fù)方新諾明(χ2=41.3338，P=0.0001)、阿米卡星(χ2=26.5861，P=0.0008)、磷霉素(χ2=30.9682，P=0.0001)耐藥率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)慶大霉素(χ2=10.813，P=0.2125)耐藥率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未發(fā)現(xiàn)對(duì)替加環(huán)素耐藥的菌株。見(jiàn)表5。

表5 碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌藥敏情況 %

2.2.3碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌藥敏情況

2018～2020年分離出碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌56株。其中，腦脊液中未分離出碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌，血液中分離出1株、體液中分離出2株。血液中分離出的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌除對(duì)替加環(huán)素敏感外，對(duì)其他抗菌藥物全部耐藥。體液中分離出的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌除對(duì)替加環(huán)素敏感外，1株對(duì)復(fù)方新諾明敏感，對(duì)其他抗菌藥物全部耐藥。尿液、痰液、其他部位分離出的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率為25%～75%。其中，痰液中分離出的耐藥率最低，尿液中分離出的耐藥率最高，對(duì)慶大霉素、阿米卡星、磷霉素、妥布霉素有一定的敏感率。未發(fā)現(xiàn)對(duì)替加環(huán)素耐藥的菌株。見(jiàn)表6。

表6 碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌藥敏情況 %

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物被認(rèn)為是抗產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶菌株的最后一道防線[4]。近年來(lái)，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，腸桿菌目細(xì)菌對(duì)其耐藥率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示，我國(guó)臨床分離肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率從2005年的3%快速攀升至2019年的25%以上，上升幅度高達(dá)8倍[5]。臨床分離出的CRE對(duì)抗菌藥物呈廣泛耐藥甚至全耐藥的特征[6]，可以選擇的抗菌藥物有限，死亡率高。研究顯示[7-8]，CRE所致侵襲性感染(如血流感染)的死亡率可達(dá)40%～50%，甚至更高。早期合理使用抗菌藥物能有效降低CRE感染導(dǎo)致的死亡率[9]。本研究對(duì)本院臨床微生物室2018～2020年分離出的CRE按感染途徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，2018～2020年CRE中排名前3位的都是肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌，其中肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌占比達(dá)90%以上，與CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的結(jié)果一致[10-11]。隨著臨床對(duì)CRE認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步提升，尤其是《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃(2016—2020年)》推廣后，在多部門的共同努力下，2018～2020年醫(yī)院CRE的檢出株數(shù)及CRE在腸桿菌目細(xì)菌中的占比持續(xù)下降。

主動(dòng)篩查在CRE的防控中具有重要意義。本研究中，不同部位來(lái)源檢出的CRE數(shù)量不同，CRE占同類標(biāo)本中腸桿菌目細(xì)菌比例不同。其中，痰液中檢出的CRE數(shù)量最多，腦脊液檢出的腸桿菌目細(xì)菌中CRE占比最高，尿液中檢出的CRE占比最低。腦脊液中檢出的CRE高，與全國(guó)數(shù)據(jù)一致[12]。這可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)相關(guān)，腦脊液中檢出的全部是碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌。痰液在臨床分離細(xì)菌的標(biāo)本來(lái)源中排名第一[10,13]，痰液中有大量的細(xì)菌定植。CRE定植導(dǎo)致CRE感染率高達(dá)16.5%[13-14]。本研究中，所有腦脊液中檢出CRE，同時(shí)段的痰液中均檢出CRE，是否為同一菌株，還需要進(jìn)一步分析。尿液中分離出腸桿菌目細(xì)菌中大腸埃希菌占比為76.55%，高于其他標(biāo)本，而碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的比例較低。因此，尿液中CRE的占比最低。主動(dòng)篩查能及時(shí)發(fā)現(xiàn)定植患者，有助于及時(shí)采取感染防控措施，預(yù)防耐藥菌的院內(nèi)傳播，降低患者死亡率[15-17]，有條件的醫(yī)院應(yīng)根據(jù)本院CRE情況開(kāi)展主動(dòng)篩查。

不同細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率不同，CRE菌株除對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥外，對(duì)其他抗菌藥物呈廣泛耐藥，僅對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明、磷霉素、四環(huán)素部分敏感。碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率低于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌；對(duì)復(fù)方新諾明、慶大霉素、阿米卡星、磷霉素部分敏感，對(duì)同類藥物的耐藥率低于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌。在不同部位來(lái)源的腸桿菌目細(xì)菌的檢出中，碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌均為第3名，占比約為3%，有上升的趨勢(shì)。目前對(duì)碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的研究較少，但是有研究表明[18]，碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌雖然為低毒細(xì)菌，但其耐藥模式、耐藥基因、多位點(diǎn)序列分型呈現(xiàn)異質(zhì)性，應(yīng)采取有效的感染預(yù)防措施，減少碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的傳播。

傳統(tǒng)臨床微生物室的工作模式為細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)同步進(jìn)行，2種結(jié)果反饋給臨床的時(shí)間間隔不長(zhǎng)。近年來(lái)，隨著基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)、分子生物學(xué)技術(shù)、宏基因組學(xué)第二代測(cè)序(以下簡(jiǎn)稱二代測(cè)序)等技術(shù)的快速發(fā)展，微生物的鑒定速度快速提升。常悅等[19]通過(guò)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與MALDI-TOF MS聯(lián)用，建立了一套可以快速、準(zhǔn)確地鑒定引起血流感染的7種常見(jiàn)病原菌檢測(cè)方法。該方法不僅可以縮短細(xì)菌的鑒定時(shí)間，還可檢測(cè)多重細(xì)菌混合感染，彌補(bǔ)混合感染漏檢可能。使用Xpert Carba-R Assay檢測(cè)系統(tǒng)可以在呼吸道感染時(shí)，直接對(duì)痰液中的CRE耐藥基因進(jìn)行鑒定[20]。使用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)尿路感染的致病菌進(jìn)行診斷[21]。二代測(cè)序可以檢測(cè)到其他傳統(tǒng)方法無(wú)法檢測(cè)到的病原體[22]。從傳統(tǒng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)診斷，不僅對(duì)臨床微生物室是一個(gè)挑戰(zhàn)，對(duì)臨床抗感染治療也是挑戰(zhàn)，臨床經(jīng)驗(yàn)用藥顯得尤為重要。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染具有起病急、病程長(zhǎng)、難治愈、死亡率高等特點(diǎn)。其中，醫(yī)院獲得性感染患者腦脊液分離常見(jiàn)病原菌是革蘭陰性桿菌[22]。本研究中，腦脊液中腸桿菌目細(xì)菌均為肺炎克雷伯菌，其中碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌占比高于30%。采用傳統(tǒng)的腦脊液培養(yǎng)方法陽(yáng)性率較低，一般低于40%[23-24]。因此，對(duì)于腦脊液培養(yǎng)結(jié)果為陰性，但是二代測(cè)序等方法檢出肺炎克雷伯菌時(shí)，應(yīng)進(jìn)行CRE感染高危因素評(píng)估[25]。如果存在長(zhǎng)期住院、入住重癥加強(qiáng)護(hù)理病房(ICU)、碳青霉烯類抗菌藥物暴露史等危險(xiǎn)因素時(shí)，應(yīng)盡早開(kāi)始CRE經(jīng)驗(yàn)性治療。

CRE菌株表現(xiàn)為多重耐藥，本研究中未發(fā)現(xiàn)對(duì)替加環(huán)素耐藥的菌株。替加環(huán)素是甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物，是半合成四環(huán)素米諾環(huán)素的衍生物，可通過(guò)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮抗菌作用[26-28]。CRE感染的有限治療，使一些藥物再次應(yīng)用于臨床一線，如多黏菌素成為治療CRE感染的重要治療藥物[29]。此外，新的抗生素及其復(fù)合制劑也不斷被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床，如頭孢他啶/阿維巴坦是一種新型頭孢菌素與β內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑，2019年5月在我國(guó)上市。該藥對(duì)產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，作為一種新藥廣泛應(yīng)用于臨床[30-31]。實(shí)驗(yàn)室對(duì)多黏菌素藥敏試驗(yàn)開(kāi)展較晚，藥敏數(shù)據(jù)較少，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但是作為針對(duì)CRE的最后防線，有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡快開(kāi)展多黏菌素藥敏試驗(yàn)，規(guī)范報(bào)告解讀，以為臨床提供用藥指導(dǎo)[32]。

不同感染部位CRE的經(jīng)驗(yàn)性治療方案不同[29,33]，對(duì)于血流感染以及呼吸道感染，推薦高劑量美羅培南聯(lián)合多黏菌素；尿路感染推薦高劑量美羅培南聯(lián)合磷霉素或者氨基糖苷類抗菌藥物。在臨床治療中，還需要考慮抗生素的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)以及毒副作用，如替加環(huán)素在血液、尿液中的濃度低，黏菌素在肺組織的穿透性差[34]，長(zhǎng)期應(yīng)用氯霉素會(huì)抑制骨髓，氨基糖苷類抗菌藥物有腎毒性和耳毒性。不同種類的抗菌藥物對(duì)產(chǎn)生不同碳青霉烯酶菌株的抗菌活性不同[33]，如頭孢他啶/阿維巴坦對(duì)產(chǎn)KPC和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對(duì)產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶菌株無(wú)抗菌活性。此外，可根據(jù)不同碳青霉烯酶的特征開(kāi)展聯(lián)合藥敏試驗(yàn)以制定精準(zhǔn)的抗感染治療方案[5]。因此，碳青霉烯酶型的確定非常重要，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)結(jié)合自身?xiàng)l件及臨床需求開(kāi)展碳青霉烯酶型的檢測(cè)。

感染途徑不同危害不同、經(jīng)驗(yàn)治療策略不同，尤其對(duì)于未培養(yǎng)出致病菌但是二代測(cè)序等檢出致病菌的危重癥患者，不同感染部位的致病菌的特點(diǎn)及對(duì)抗菌藥物的耐藥率的統(tǒng)計(jì)分析對(duì)于制定抗感染治療方案具有重要意義。CRE引起的感染死亡率高，可選擇的抗菌藥物少。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)不同感染部位CRE的檢出情況、菌株分布情況及耐藥情況對(duì)于臨床合理使用抗菌藥物、改善患者結(jié)局、減輕患者疾病負(fù)擔(dān)具有重要意義。