裴保方，陶興茹，劉 煒，郭鵬波，呂 萌，馬姝麗

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 1 藥學(xué)部，2 血液腫瘤科，3 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450018)

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是常見的兒童白血病類型之一。大劑量甲氨蝶呤(high-dose methotrexate，HD-MTX)在ALL患兒維持治療中發(fā)揮著重要的作用[1]，但在臨床治療過程中，患兒對(duì)HD-MTX的敏感性和藥物不良反應(yīng)存在明顯的個(gè)體差異。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝途徑中參與催化亞甲基四氫葉酸生成甲基四氫葉酸的關(guān)鍵酶之一[2]，也是MTX發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵酶之一，其基因多態(tài)性可能與MTX化療后血藥濃度及藥物不良反應(yīng)相關(guān)。本研究旨在探討MTHFRA1298C和MTHFRC677T基因多態(tài)性與ALL患兒HD-MTX化療后血藥濃度及藥物不良反應(yīng)的關(guān)系，為MTX的合理應(yīng)用及藥物不良反應(yīng)預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月～2019年9月在本院兒童血液腫瘤科確診的ALL住院患兒77例作為研究對(duì)象。其中，男性患兒56例，女性患兒21例；最小年齡1歲4個(gè)月，最大年齡14歲，平均年齡(4.88±2.48)歲?；純阂话阗Y料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批件號(hào):2020-K-022)。本研究為利用以往臨床診療中獲得的病例/生物標(biāo)本的研究，經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)免除知情同意。

表1 患兒一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：每例患兒的診斷均參照《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第四次修訂)》[3]，所有患兒均處于鞏固治療階段。

排除標(biāo)準(zhǔn)：① 早期強(qiáng)化療后未完全緩解者。② 使用過程中出現(xiàn)嚴(yán)重過敏反應(yīng)者。③ 嚴(yán)重心、肺、肝腎功能不全者。

1.2 治療方法

參照兒童ALL治療建議，甲氨蝶呤注射液(Pfizer Australia Pty Ltd,注冊(cè)證號(hào)H20140207,規(guī)格1000 mg/10 ml)給藥劑量為低危組2.0 g/m2、中高危組5.0 g/m2，總劑量的1/10作為突擊量于前0.5 h內(nèi)快速靜脈滴入，余量于后23.5 h內(nèi)勻速滴入。突擊量MTX滴入后2 h內(nèi)，進(jìn)行三聯(lián)鞘內(nèi)注射：甲氨蝶呤注射液+注射用阿糖胞苷(Pfizer Italia s.r.l.，國(guó)藥準(zhǔn)字HJ20160403，規(guī)格0.1 g)+地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020516，規(guī)格1 ml∶2 mg)，同時(shí)給予大劑量水化、堿化治療；MTX滴注48 h后進(jìn)行四氫葉酸鈣(CF)解救治療，之后根據(jù)MTX血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)整CF解救方案，直至MTX血藥濃度≤0.3 μmol/L(機(jī)器可檢測(cè)最低范圍)時(shí)停止解救。

1.3 基因分型

MTHFRA1298C和MTHFRC677T基因檢測(cè)試劑盒購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司；血藥濃度監(jiān)測(cè)采用西門子Viva-E2000全自動(dòng)藥物濃度分析系統(tǒng)(德國(guó)德靈診斷公司)。

目的片段的引物分別是5’-CAGTCCCTGTGGTCTCTTCAT-3’和5’-CTCACCTGGATGGGAAAGAT-3’與5’-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3’和5’-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3’。PCR反應(yīng)體系為25 μl，含有模板DNA 0.1 μg、各引物0.4 μmol/L、脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)0.2 mmol/L、MgCl 21.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶及其1×緩沖液1.0 U。反應(yīng)在ABI Verity熱循環(huán)儀上進(jìn)行，95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s和72 ℃ 20 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 ℃，后者的退火溫度是58 ℃。

1.4 MTX血藥濃度監(jiān)測(cè)

HD-MTX開始后48和72 h采患兒靜脈血2 ml，采用酶放大免疫法測(cè)定MTX血藥濃度，若48 h時(shí)MTX血藥濃度≤0.3 μmol/L，可不予測(cè)定72 h MTX血藥濃度。

1.5 藥物不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)

HD-MTX化療期間，觀察記錄患兒藥物不良反應(yīng)，根據(jù)美國(guó)國(guó)立癌癥研究所常規(guī)毒性判定標(biāo)準(zhǔn)4.0版(NCI-CTC 4.03)及《抗癌藥物急性及亞急性毒性反應(yīng)分度標(biāo)準(zhǔn)(WHO)》[4]，對(duì)藥物不良反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)，分級(jí)≥Ⅱ級(jí)被認(rèn)為是臨床相關(guān)的化療不良反應(yīng)。不良反應(yīng)評(píng)價(jià)觀察指標(biāo)有：外周血中性粒細(xì)胞減少(N<1.5×109/L)、血紅蛋白降低(Hb<95 g/L)和血小板減少(PLT<75×109/L)、胃腸道反應(yīng)(暫時(shí)性嘔吐、腹瀉能耐受≥2天)、黏膜損害(口腔紅斑、潰瘍)、肝臟損害(谷丙轉(zhuǎn)氨酶≥2.5倍正常值上限)、腎臟毒性(尿素氮≥2.5倍正常值上限)等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同基因型間藥物不良反應(yīng)比較，計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，用非線性logistic回歸分析計(jì)算比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)表明不同基因型發(fā)生不良反應(yīng)的可能性。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR A1298C與ALL患兒HD-MTX化療后藥物不良反應(yīng)的關(guān)系

MTHFRA1298CAA型患兒較AC+CC型發(fā)生血小板減少的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.10倍(OR=2.10,95%CI:0.23～19.08,P<0.05)，胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生率增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，不同基因型患兒中性粒細(xì)胞減少、血紅蛋白降低、黏膜損害、肝臟損害等藥物不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 MTHFR A1298C與HD-MTX化療后藥物不良反應(yīng)的關(guān)系 n=77,n(%)

2.2 MTHFR C677T與ALL患兒HD-MTX化療后藥物不良反應(yīng)的關(guān)系

與CT和TT型相比，MTHFRC677TCC型患兒血小板減少、血紅蛋白降低和黏膜損害的發(fā)生率明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，不同基因型患兒中性粒細(xì)胞減少、胃腸道反應(yīng)和肝臟損害等藥物不良反應(yīng)發(fā)生率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 MTHFR C677T與HD-MTX化療后藥物不良反應(yīng)的關(guān)系 n=77,n(%)

2.3 MTHFR基因多態(tài)性與48 h MTX血藥濃度的相關(guān)性

MTHFRA1298C和MTHFRC677T不同基因型與HD-MTX用藥后48 h血藥濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P>0.05)，提示MTHFR基因多態(tài)性不影響MTX的排泄。見表4。

表4 MTHFR基因多態(tài)性與48 h MTX血藥濃度的關(guān)系 n=77,n(%)

3 討論

MTHFR是參與葉酸代謝和DNA合成的重要輔酶[5]，可催化5,10亞甲基四氫葉酸還原為具有生物學(xué)功能的5-甲基四氫葉酸，而后者主要使脫氧鳥嘧啶核苷酸(dUMP)甲基化為脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)，并參與DNA合成和修復(fù)[6]。MTHFRA1298C和MTHFRC677T是2個(gè)最常見的多態(tài)性位點(diǎn)，其多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致酶活性的改變，可能會(huì)改變?nèi)~酸拮抗劑的化療反應(yīng)[7]。MTHFR基因多態(tài)性與MTX用藥后血藥濃度變化及化療后藥物不良反應(yīng)的關(guān)系已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

目前，關(guān)于MTHFRA1298C和C677T基因多態(tài)性與HD-MTX化療相關(guān)不良反應(yīng)的關(guān)系已有報(bào)道，但結(jié)果不一。本研究結(jié)果顯示，MTHFR1298AA基因型與AC+CC基因型相比，其發(fā)生血小板減少的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.1倍，胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生率增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在其他藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與Umerez等[8]的研究結(jié)果一致。此外，樊春艷等[9]的研究發(fā)現(xiàn)攜帶MTHFRA1298CAA基因型的ALL患兒發(fā)生MTX化療后胃腸道反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較AC+CC基因型高4.513倍，其他基因型與MTX化療后藥物不良反應(yīng)則無關(guān)聯(lián)。而Zhu等[10]薈萃分析了14項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MTHFRA1298C基因多態(tài)性與兒童HD-MTX的化療后不良反應(yīng)發(fā)生無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性；Tantawy等[11]研究發(fā)現(xiàn)MTHFRA1298C多態(tài)性對(duì)ALL患者化療毒性及生存無統(tǒng)計(jì)學(xué)影響。研究結(jié)果的差異可能受到聯(lián)合用藥、基因頻率、當(dāng)時(shí)葉酸水平以及樣本數(shù)量的影響[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)與CT和TT基因型相比，MTHFRC677TCC型患兒血小板減少、血紅蛋白降低和黏膜損害的發(fā)生率升高(P<0.05)，且未發(fā)現(xiàn)MTHFRC677T各基因型與中性粒細(xì)胞減少、胃腸道反應(yīng)和肝臟損害等藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(P<0.05)。此研究結(jié)果與部分國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果一致。Mahmoud等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與MTHFRC677TCC野生型相比，MTHFRC677TTT基因型患者發(fā)生肝功能異常和黏膜損害的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，而MTHFRC677TCT+TT型基因患兒發(fā)生血小板減少的風(fēng)險(xiǎn)同樣增加。另外，高珊等[14]研究顯示攜帶MTHFRC677TTT基因型的患兒發(fā)生MTX藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)比CC野生型攜帶者更高。然而，陳先睿等[15]的Meta分析結(jié)果顯示，MTHFRC677T不同基因型患者M(jìn)TX化療后藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；不同地區(qū)、不同人群MTHFRC677T多態(tài)性與MTX化療后藥物不良反應(yīng)相關(guān)性研究的結(jié)果并不完全一致，亞葉酸鈣(CF)在一定程度上可能會(huì)降低血同型半胱氨酸水平[16]。同時(shí)，在本研究過程中,考慮到HD-MTX化療后藥物不良反應(yīng)可能會(huì)受到給藥劑量、CF的解救劑量、是否充分水化、堿化等因素的影響，ALL患兒的水化、堿化方案以及CF解救方案均嚴(yán)格參照中國(guó)兒童腫瘤臨床多中心研究協(xié)作組ALL治療研究方案(CCCG-ALL-2015)，且研究入組患兒中高?；純赫?6.10%，MTX給藥劑量均按照5 g/L方案給藥，進(jìn)一步排除了給藥劑量對(duì)研究結(jié)果的影響。

本研究結(jié)果提示，MTHFR基因多態(tài)性與MTX用藥后48 h血藥濃度變化無關(guān)，MTHFR基因多態(tài)性并不影響MTX的排泄。此研究結(jié)果與部分學(xué)者研究一致。王軼睿等[17]對(duì)大劑量甲氨蝶呤化療后藥物不良反應(yīng)的影響因素進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示不同MTHFR基因型、性別及年齡對(duì)MTX用藥后48 h的血藥濃度變化并無統(tǒng)計(jì)學(xué)影響。而李靜等[18]研究了MTHFRC677T基因多態(tài)性與HD-MTX化療后ALL患兒MTX血藥濃度變化的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)，MTHFRC677T不同基因型患兒24 h血藥濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而48 h血藥濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

綜上所述，MTHFRA1298C和MTHFRC677T基因多態(tài)性與ALL患兒HD-MTX化療后藥物不良反應(yīng)的發(fā)生有一定的相關(guān)性，但并不影響MTX的排泄。由此，可以在ALL患兒接受HD-MTX化療之前，通過檢測(cè)MTHFR基因型來預(yù)測(cè)MTX毒性反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)患兒個(gè)體化用藥。MTX的藥物代謝、排泄及其所致的藥物不良反應(yīng)可能受到多種因素的影響，對(duì)于本研究的結(jié)果，在后續(xù)工作中還將通過擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行驗(yàn)證，以期為在ALL患兒HD-MTX化療過程中實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥提供有效的依據(jù)。