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        1例13號染色體復(fù)雜嵌合型結(jié)構(gòu)畸變的細(xì)胞遺傳學(xué)分析

        2021-11-06 02:40:42李顯箏許玲蔡嬋慧胡晶晶
        關(guān)鍵詞:嵌合體核型絨毛

        李顯箏 許玲 蔡嬋慧 胡晶晶

        (廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心,廣東 廣州 511442)

        絨毛染色體核型分析是孕早期常見的產(chǎn)前診斷方法之一。相對于羊水染色體核型分析,絨毛核型分析更容易出現(xiàn)嵌合體,而這些嵌合體有些是真性嵌合,有些是假性嵌合,如何鑒別和預(yù)測這些嵌合體對胎兒的風(fēng)險(xiǎn),是產(chǎn)前診斷中的一大難題[1]。目前,臨床上絨毛嵌合體多數(shù)為非整倍體數(shù)目異常嵌合,染色體結(jié)構(gòu)重排畸變嵌合比較少見(79.3%vs 20.7%)[2]。本文將探討1例13號染色體復(fù)雜結(jié)構(gòu)畸變的嵌合體病例,并深入探討其可能發(fā)生的機(jī)制。

        1 對象與方法

        1.1 對象 孕婦,43歲,2019年3月27日來本院就診。末次月經(jīng)為2018年12月19日,于2018年12月23日通過體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer,IVF/ICSI-ET)手段植入2枚冷凍胚胎,早期超聲提示存活1枚。2009年順產(chǎn)一女,現(xiàn)體健,平素月經(jīng)規(guī)則,無特殊,夫妻雙方外周血染色體核型均正常。孕12+周左右,超聲提示宮腔內(nèi)單活胎,胎兒頸項(xiàng)透明層厚度(nuchal translucency,NT)4.7mm。就診完善相關(guān)檢查,孕婦及家屬簽署知情同意書,于孕14+周,經(jīng)腹B超行絨毛膜穿刺術(shù),同時送檢絨毛染色體核型分析及染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)檢測。因絨毛染色體結(jié)果提示嵌合體,孕婦于孕18+周,經(jīng)腹B超行羊膜腔穿刺術(shù),再次送檢羊水核型分析及CMA檢測。

        1.2 方法

        1.2.1 絨毛染色體核型分析孕11~15周孕婦在B超介導(dǎo)下經(jīng)腹穿刺絨毛20~30mg,用無菌生理鹽水清洗干凈后,送至無菌培養(yǎng)室,于解剖顯微鏡下挑選出絨毛組織,經(jīng)無菌手術(shù)刀剁碎和酶消化后,接種到3個培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)觀察,1瓶進(jìn)行原位收獲、制片,1瓶傳代、收獲和制片,另1瓶留作備份繼續(xù)培養(yǎng),于顯微鏡下分析計(jì)數(shù)核型,若出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象時加大計(jì)數(shù)量并對備份培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞進(jìn)行傳代、收獲和制片,加數(shù)盡量多的核型進(jìn)行分析。

        1.2.2 羊水染色體核型分析本中心采用原位羊水細(xì)胞培養(yǎng)法,孕婦于孕18~24周在B超介導(dǎo)下經(jīng)腹穿刺羊水30ml,雙人雙線操作,接種2個培養(yǎng)瓶和2個培養(yǎng)皿,常規(guī)羊水培養(yǎng),將2個培養(yǎng)瓶進(jìn)行原位收獲和制片,顯微鏡下計(jì)數(shù)15個細(xì)胞克隆,分析5個核型,若出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象時加大計(jì)數(shù)量并對2個備份培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行傳代、收獲和制片,加數(shù)盡量多的核型進(jìn)行分析。

        1.2.3 CMA檢測簽署知情同意書后,采集孕婦絨毛或羊水。使用Agilent公司生產(chǎn)的8×60K芯片進(jìn)行全基因組范圍的不平衡現(xiàn)象檢測。整個過程嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化操作進(jìn)行,包括DNA的提取、酶切、連接、PCR、純化、片段化、標(biāo)記、雜交、掃描和分析。最終以正常男性DNA作為對照標(biāo)準(zhǔn),利用Ch AS軟件進(jìn)行分析。

        2 結(jié)果

        2.1 經(jīng)腹超聲結(jié)果經(jīng)腹部超聲掃查提示:子宮增大,宮腔內(nèi)見一胎兒回聲,頭臀徑63mm,可見胎心搏動,胎兒NT4.7mm,胎盤位于子宮前壁,厚16mm,胎盤成熟度0度,羊水暗區(qū)31mm,子宮宮底壁見1個低回聲團(tuán),大小約23mm×12mm,邊界清,內(nèi)部回聲分布均勻,圖1。

        圖1 超聲結(jié)果:NT4.7mm

        2.2 染色體G顯帶核型結(jié)果絨毛染色體核型分析共發(fā)現(xiàn)3種異常核型:①46,XX,del(13)(q22);②46,XX,-13,+mar;③46,XX,add(13)(q22),均涉及13號染色體,嵌合比例分別為50%、30%和20%,圖2A-C,羊水染色體核型分析結(jié)果為46,XX,del(13)(q31.1),胎兒僅存在一種異常核型,圖2D。

        圖2 染色體核型結(jié)果

        2.3 染色體微陣列檢測結(jié)果絨毛染色體微陣列結(jié)果提示:arr[hg19]10q22.1q26.3(70,857,961-135,426,386)x2-3,13q22.1q34(74,346,851-115,107,733)x1-2,發(fā)現(xiàn)胎兒存在兩種基因拷貝數(shù)的變化:①10號染色體10q22.1-q26.3位置發(fā)生嵌合重復(fù)(比例約23%),片段大小約64.6Mb,包含616個基因;②13號染色體13q22.1-q34位置發(fā)生嵌合缺失(比例約40%),片段大小約40.7Mb,涉及251個基因,圖3A。

        羊水染色體微陣列結(jié)果提示:arr[hg19]13q31.1q34(84,336,388-115,107,733)x1,發(fā)現(xiàn)胎兒13號染色體13q31.1-qter位置發(fā)生缺失,片段大小約40.7Mb,涉及251個基因,其中97個為OMIM基因,圖3B。

        圖3 染色體微陣列結(jié)果

        3 討論

        絨毛是胚胎和母體進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組成部分[3]。絨毛染色體核型G顯帶分析技術(shù)在臨床中具有早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)、降低孕婦心理及身體創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn),但其技術(shù)手段仍存在一定的弊端[4]。眾所周知,胎盤由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜構(gòu)成,羊膜和葉狀絨毛膜構(gòu)成胎盤的胎兒部分,葉狀絨毛膜是絨毛穿刺的目標(biāo)物[5];底蛻膜構(gòu)成胎盤的母體部分,絨毛穿刺時不慎抽到底蛻膜是造成母體組織污染的主要原因[6]。同時,由于絨毛取材過程中易污染、取材難度大、絨毛量多少不同、孕周不同、培養(yǎng)時間長短等因素,對最終絨毛染色體結(jié)果都會造成不同程度的影響[7]。

        絨毛檢查所取標(biāo)本主要為滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞,雖然與胎兒來源于同一個受精卵,屬于胎盤的一部分,但其并非真正的胎兒組織。在胚胎發(fā)育至64個細(xì)胞胚泡階段,4個細(xì)胞發(fā)育成胎兒,12個細(xì)胞發(fā)育成胚外中胚層,其余48個細(xì)胞發(fā)育成滋養(yǎng)層,在胚胎發(fā)育早期,理論上非胎兒結(jié)構(gòu)比胎兒更容易發(fā)生有絲分裂錯誤[8]。一般情況下絨毛核型能代表胎兒核型,但也可能由于母體組織污染或者限制性胎盤嵌合體(CPM)的存在,不能真實(shí)反映胎兒情況。當(dāng)絨毛染色體嵌合現(xiàn)象發(fā)生時,應(yīng)首先鑒別胎兒真性嵌合的可能性。如果在胚胎時期,細(xì)胞融合或分裂錯誤形成嵌合體,一般是真性嵌合體[9]。所以,準(zhǔn)確分析判斷絨毛染色體嵌合體的真假性,排除CPM的可能,對胎兒及妊娠結(jié)局的影響是非常重要的。

        在孕早期絨毛活檢中,CPM的發(fā)生率大約在1%~2%[10]。當(dāng)發(fā)生CPM時,絨毛核型與胎兒核型結(jié)果可能出現(xiàn)不一致,出現(xiàn)絨毛嵌合現(xiàn)象。目前,CPM根據(jù)發(fā)生機(jī)制,可分為減數(shù)分裂型以及有絲分裂型:減數(shù)分裂型指受精卵染色體異常,在之后的分裂中,由于“錯誤”導(dǎo)致囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中形成胚胎的細(xì)胞丟失異常染色體,而其余異常細(xì)胞被“驅(qū)趕”至滋養(yǎng)細(xì)胞層,這個過程被稱為“胎兒自救”(fetal rescue);有絲分裂型指受精卵染色體正常,異常分裂發(fā)生在胎盤細(xì)胞的前體中[11]。對于絨毛染色體發(fā)現(xiàn)異常核型嵌合現(xiàn)象時,不能盲目認(rèn)定胎兒染色體存在異常,需進(jìn)一步復(fù)查羊水,但即使后續(xù)羊水診斷核型結(jié)果正常,胎兒仍可能存在低水平的嵌合,并且有1/3的機(jī)會是單親二體(uniparental disomy,UPD),對于某些可能存在印記基因的染色體,例如5、6、7、9、11、14、15、16號染色體,診斷CPM的同時還要除外UPD的存在[5]。

        本病例絨毛核型與CMA結(jié)果均提示13號染色體存在異常。由于CMA的結(jié)果提示10號染色體存在嵌合重復(fù),且重復(fù)片段斷裂位點(diǎn)位于10q22,結(jié)合第三種異常核型,與10號染色體帶紋進(jìn)行比對,我們認(rèn)定第三種異常核型中的未知13號染色體為一條衍生染色體,其未知附加片段來源為10號染色體的部分三體,同時伴隨13號q22位置至末端的部分單體,其核型描述修正為:46,XX,der(13)t(10;13)(q22;q22)。CMA提示10號染色體嵌合重復(fù)的比例為23%,而13號染色體嵌合缺失的比例為40%,除了10號與13號染色體易位重排的衍生染色體外,還存在13號q22至末端缺失的情況,即第一種異常核型46,XX,del(13)(q22)。由于核型分析與CMA技術(shù)均存在局限性,不能排除絨毛CPM的存在,同時CMA技術(shù)對低比例的嵌合不能準(zhǔn)確檢出,所以第二種異常核型仍不能確認(rèn)其來源及異常類型,需進(jìn)一步復(fù)查羊水。經(jīng)檢測,羊水染色體核型分析以及CMA結(jié)果均提示胎兒為純合狀態(tài)的13號染色體q31至末端的缺失,“13p缺失綜合征”主要臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的智力障礙、特殊面容、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、肌張力低下等,孕婦及家屬選擇終止妊娠。

        該病例絨毛與羊水檢測出現(xiàn)了不同的結(jié)果,經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),絨毛核型與絨毛CMA結(jié)果基本一致,羊水核型與羊水CMA結(jié)果一致,從而排除由于細(xì)胞體外培養(yǎng)、收獲等操作造成的假性嵌合現(xiàn)象,可以確定該病例CPM的存在,推測13號染色體的畸變細(xì)胞異常分裂可能發(fā)生在減數(shù)分裂期,由于胎兒復(fù)雜的自救過程,導(dǎo)致胎盤存在三種不同形式的異常核型的嵌合,而胎兒由一種異常核型發(fā)育而來。遺憾的是本病例外院引產(chǎn),未能留取胎盤組織進(jìn)一步印證。

        綜上所述,絨毛核型分析的嵌合現(xiàn)象仍然是產(chǎn)前診斷和咨詢中的難點(diǎn)。雖然CPM的發(fā)生率較低,當(dāng)絨毛核型分析發(fā)現(xiàn)嵌合體時仍應(yīng)充分考慮CPM的可能性,復(fù)查羊水或臍帶血進(jìn)一步確診。臨床上應(yīng)重視CPM的存在,加強(qiáng)對CPM的遺傳咨詢。對于存在CPM且胎兒核型正常的妊娠,孕期應(yīng)加強(qiáng)對胎兒生長發(fā)育的監(jiān)測,分娩時留取胎盤多點(diǎn)取材,分別檢測染色體核型進(jìn)一步印證。

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