張秀英，張 丹，馬勉娣，唐 昕，胡志芳，程安富，劉 毅，張孟艷，魯興凱*

（1.昭通市蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，云南 昭陽(yáng) 657000；2.鎮(zhèn)雄縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局經(jīng)作辦，云南 鎮(zhèn)雄 657200）

蘋果屬（Malus Mill）是薔薇科（Rosaceae）中一個(gè)屬，全世界約有38種，分布于北美洲、亞洲和歐洲等地，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。中國(guó)約有30種，其中特有品種為16種[1]，是世界主要栽植果樹品種之一。蘋果組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可對(duì)母本的優(yōu)良性狀進(jìn)行保持、提純或復(fù)壯，而且離體培養(yǎng)下繁殖體個(gè)體小、群體大，可控的環(huán)境還能消除季節(jié)因素的限制，從而顯著地提高了繁殖效率，從而成為蘋果植物快速繁殖的一條重要途徑。

植物體中可選擇莖尖、莖段、子葉、胚、原生質(zhì)體和花藥等作為外植體，通過(guò)不同培養(yǎng)途徑獲得再生植株，但不同外植體的再生能力不同，因此，合適外植體的選擇是組織培養(yǎng)成功的前提。目前，利用蘋果外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的污染率參差不齊，重復(fù)性較差，應(yīng)用效果不佳，有時(shí)污染率高達(dá)80%，嚴(yán)重制約了蘋果組織培養(yǎng)進(jìn)度。本試驗(yàn)就組培過(guò)程中外植體的獲取方法進(jìn)行了研究，為蘋果組培苗木繁育技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽苗：取自昭通主栽品種（秦脆、瑞陽(yáng)、華碩等）1年生幼苗。其他材料：MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、6-BA、吲哚丁酸（IBA）、聚乙烯醇、升汞（0.1%）、酒精（75%）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 前處理

在早春2—3月，將前1年移栽或嫁接成活的蘋果盆栽苗移入溫室，適應(yīng)高溫環(huán)境，待萌芽抽枝后，放入人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行恒溫?zé)崽幚?。處理溫度調(diào)節(jié)在37℃、濕度90%、每天光照12.5 h，光照度為22000 Lx，處理時(shí)間35 d。

1.2.2 切取外植體

待人工氣候箱內(nèi)的盆栽苗萌發(fā)抽生新枝，頂芽或腋芽萌發(fā)長(zhǎng)度達(dá)到0.5～2 cm時(shí)，立即剪取莖尖（葉片較多的莖尖部位要去除多余的葉子，只保留生長(zhǎng)點(diǎn)附近1～2片葉）及芽點(diǎn)放入裝有自來(lái)水的燒杯中，防止失水枯萎。剪取時(shí)要盡量靠近生長(zhǎng)點(diǎn)，距離生長(zhǎng)點(diǎn)0.5 cm左右為宜。芽點(diǎn)剪取方法見圖1。

圖1 莖尖及芽點(diǎn)切取圖

1.2.3 自來(lái)水沖洗

先在裝有外植體的燒杯上方蒙上一層紗布，再在自來(lái)水下沖洗30～40 min，去除采集的外植體上的灰塵等。

1.2.4 酒精消毒

將沖洗完畢的外植體拿到超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理，自來(lái)水倒掉后，倒入75%酒精，并計(jì)時(shí)浸泡30 s，隨后用無(wú)菌水沖洗2～3遍。

1.2.5 升汞消毒

酒精消毒后外植體放入0.1%升汞中消毒5～7 min，再用無(wú)菌水浸洗3～5遍。

1.2.6 分化增殖培養(yǎng)

將升汞消毒后的外植體接種在MS培養(yǎng)基上，附加6-BA 0.8 mg·L-1，IBA 0.2 mg·L-1，蔗糖40 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，聚乙烯醇2 g·L-1，pH值6.0[2]。

1.3 指標(biāo)計(jì)算方法

污染率（%）=（真菌或者細(xì)菌污染的芽數(shù)/供試芽數(shù)）×100

成活率（%）=（未死亡的芽數(shù)/未被污染的芽數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

由表1可以看出，通過(guò)此方法獲取組培外植體，與常規(guī)獲取組培外植體相比，增加了恒溫?zé)崽幚聿襟E，同時(shí)規(guī)定了外植體長(zhǎng)度、消毒步驟，利用蘋果在高溫條件下生長(zhǎng)出來(lái)的莖尖及芽點(diǎn)進(jìn)行接種培養(yǎng)，使得染菌率低至0%；但剪取的芽點(diǎn)長(zhǎng)度直接影響組培苗的成活率，當(dāng)外植體長(zhǎng)度小于0.5 cm時(shí)，由于幼嫩芽體耐受性差，芽點(diǎn)褐化嚴(yán)重，所以成活率只有35%；當(dāng)外植體長(zhǎng)度在0.5～2 cm時(shí)，成活率能達(dá)到85%以上，且繁殖能力非常強(qiáng)。分化增殖培養(yǎng)后的芽點(diǎn)生長(zhǎng)情況見圖2。

表1 切取的芽點(diǎn)長(zhǎng)度對(duì)組培苗成活率的影響

圖2 分化增殖培養(yǎng)后的芽點(diǎn)生長(zhǎng)情況

3 討論

在植物組織培養(yǎng)中，關(guān)于組培方面的報(bào)道很多，但利用蘋果外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的污染率參差不齊，成活率不高，重復(fù)性較差，應(yīng)用效果不佳，有時(shí)污染率高達(dá)80%，嚴(yán)重制約了蘋果組織培養(yǎng)進(jìn)度，因而如何降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化工藝，提高繁殖系數(shù)和成活率，達(dá)到規(guī)?；?、商品化生產(chǎn)是組培技術(shù)研究的重要方向[3]。陳冉冉等通過(guò)剝?nèi)√O果砧木系SH6莖尖培養(yǎng)組培苗，成活率僅為20%[4]。龐曼等通過(guò)研究蘋果外植體的消毒方法，污染率最低為48%，成活率最高僅為42%[5]。本實(shí)驗(yàn)研究利用蘋果熱處理脫毒方法，通過(guò)規(guī)定所取外植體長(zhǎng)度、消毒步驟，顯著降低了利用外植體獲得組培苗的染菌率，低至0%，較之前技術(shù)相比提高了75%～92%；同時(shí)顯著提高了利用外植體獲得組培苗的成活率，達(dá)到85%，且繁殖能力非常強(qiáng)。