肖茂春 劉淑云 張雨菲 王立宇 殷澤登

變應(yīng)性鼻炎（Allergic Rhinitis,AR）是一種常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病，其患病率不斷上升，對(duì)患者健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成很大的負(fù)擔(dān)[1，2]。中醫(yī)藥在A(yíng)R治療中發(fā)揮重要的作用，研究證實(shí)蒼耳子和辛夷均有抗炎、抗過(guò)敏、抗組胺等作用，兩者配伍后可降低蒼耳子的毒性作用，并增強(qiáng)抗炎作用[3，4]，但兩種藥物配伍治療AR的生物學(xué)機(jī)制目前還沒(méi)有闡明。本研究通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)篩選蒼耳子及辛夷的活性成分，預(yù)測(cè)活性成分的生物靶點(diǎn)，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和抗AR靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體上探索蒼耳子配伍辛夷治療AR的潛在生物學(xué)機(jī)制，為臨床研制新的治療AR的藥物提供思路。

資料與方法

1 篩選蒼耳子及辛夷有效成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）“Herb name”檢索窗口分別輸入蒼耳子及辛夷，選擇生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18，篩選出蒼耳子和辛夷的有效成分，并檢索確定有效成分可能的作用靶點(diǎn)。

2 篩選潛在靶點(diǎn)

將蒼耳子及辛夷的潛在作用靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)化成與人類(lèi)對(duì)應(yīng)的基因名稱(chēng)。分別在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）、Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和PGKB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.pharmgkb.org/）中檢索與“allergic rhinitis”相關(guān)的基因，取上述靶基因并集作為AR的靶基因集，并將藥物有效成分的潛在作用靶基因和AR的靶基因集對(duì)比取相交區(qū)域，獲得蒼耳子及辛夷治療AR的有效成分的靶基因。

3 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的蒼耳子和辛夷的靶基因?qū)隨tring Version 11數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/），選擇默認(rèn)設(shè)置，將結(jié)果中的“node1,node2,combined Score”信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，作圖并分析。分別采用節(jié)點(diǎn)的大小與邊的粗細(xì)來(lái)反映degree及combined score的大小，最終獲得蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

4 分析生物過(guò)程和通路

在https://www.r-project.org/下載、安裝R軟件，采用R平臺(tái)對(duì)蒼耳子和辛夷治療AR的有效成分的靶基因進(jìn)行基因本體（GO）生物過(guò)程和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析（以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)判斷相關(guān)性）。

結(jié)果

1 蒼耳子配伍辛夷的有效活性化合物

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到了111個(gè)蒼耳子的化學(xué)成分，184個(gè)辛夷的成分，符合OB值≥30%，DL≥0.18篩選條件的有11個(gè)蒼耳子的活性成分，19個(gè)辛夷的活性成分，見(jiàn)表1。

表1 蒼耳子和辛夷活性成分及部分參數(shù)

藥物 TCMSP編號(hào) Molecule Name OB MOL012130 (2S,3R,3aR,7R,7aS)-7-allyl-2-(1,3-benzodioxol-5-yl)-3a,4-dimethoxy-3-methyl-2,3,4,7a-tetrahydrobenzofuran-6-one 59.37 DL 0.51 MOL012131 isodihydrofutoquinol a 60.54 0.36 MOL012136 5-p(2S,3S,4R,5R)-5-(3,4-dimethoxyphenyl)-3,4-dimethyl-2-tetrahydrofuranyl]-1,3-benzodioxole 60.11 0.45 MOL012137 magnolone 50.56 0.55 MOL000310 Denudatin B 61.47 0.38 MOL000313 Galgravin 57.12 0.39 MOL00314 (2S,3S,4S,5S)-2,5-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-3,4-dimethyltetrahydrofuran 57.12 0.39 MOL001494 Mandenol 42.00 0.19 MOL000315 hancinone 39.31 0.44 MOL007563 Yangambin 57.53 0.81 MOL009849 ZINC05223929 31.57 0.83

2 AR相關(guān)靶基因的篩選及與藥物靶基因的對(duì)比分析

利用Genecard等四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，收集了AR相關(guān)靶基因1590個(gè)，與蒼耳子及辛夷篩選后得到的活性成分的38個(gè)靶基因進(jìn)行交集分析，得到18個(gè)抗AR靶基因（圖1中相交區(qū)域）。

圖1 變應(yīng)性鼻炎靶基因與兩種藥物靶基因交集圖

3 蒼耳子配伍辛夷有效分子與抗AR靶點(diǎn)基因的網(wǎng)絡(luò)圖

運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件將藥物有效成分以及抗AR靶點(diǎn)基因制作成網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），綠色代表抗AR的靶基因，黃色代表藥物有效的成分，連線(xiàn)代表各自間的作用關(guān)系。

圖2 兩種藥物抗變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)基因的網(wǎng)絡(luò)圖

4 蒼耳子配伍辛夷抗AR靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用String Version11，預(yù)測(cè)和構(gòu)建18個(gè)抗AR靶點(diǎn)蛋白-蛋白的作用分子網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)節(jié)點(diǎn)度（degree）等拓?fù)鋮?shù)評(píng)價(jià)靶點(diǎn)的重要性，其中CASP3、ESR1、MYC、CASP9、BCL2、GSK3B等蛋白靶點(diǎn)的度值較高，度值越高，關(guān)鍵靶蛋白的可能性越大，而PTGS1蛋白質(zhì)與其他17個(gè)蛋白質(zhì)無(wú)相互作用（圖3）。

圖3 兩種藥物抗變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)蛋白相互作用預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)

5 蒼耳子配伍辛夷抗AR的GO生物功能分析

在對(duì)18個(gè)潛在靶點(diǎn)GO生物過(guò)程富集分析中，發(fā)現(xiàn)其主要富集在細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡通路以及細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)等43個(gè)生物過(guò)程中（P＜0.05），表2展示P＜0.005的生物過(guò)程。研究表明上述生物過(guò)程在A(yíng)R中起到了重要的抗過(guò)敏、抗炎作用。在GO分子功能富集分析中，我們發(fā)現(xiàn)其與胺受體、核受體和類(lèi)固醇激素、轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)遞質(zhì)等受體活性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，見(jiàn)圖4。

表2 兩種藥物抗變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)GO生物過(guò)程分析結(jié)果（P＜0.005）

圖4 兩種藥物抗變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)GO分子功能分析結(jié)果

6 蒼耳子配伍辛夷抗AR的KEGG富集通路分析

在KEGG通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，18個(gè)靶點(diǎn)主要富集在18條信號(hào)通路上，主要有PI3K-Akt、甲狀腺激素、細(xì)胞凋亡、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乙型肝炎等相關(guān)信號(hào)通路，這些通路互相作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、代謝等多種生物學(xué)功能，見(jiàn)圖5。

圖5 兩種藥物抗變應(yīng)性鼻炎靶點(diǎn)KEGG富集通路分析結(jié)果

討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球AR發(fā)病率10%～20%，防治AR成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)和難點(diǎn)[1]。2015版中國(guó)藥典提到蒼耳子和辛夷功能主治散風(fēng)寒，通鼻竅，祛風(fēng)濕，用于風(fēng)寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵等[5]。研究表明蒼耳子具有良好的抗過(guò)敏、抗炎和鎮(zhèn)痛作用，可以減少?lài)娞绾捅前W癥狀的發(fā)作頻率，辛夷具有抗過(guò)敏、抗炎、血管生成、抗增殖、Ca2+通道拮抗和抗微生物活性等藥理作用，二者均有抗過(guò)敏、抗炎的作用[6，7]。臨床應(yīng)用中，多見(jiàn)以蒼耳子配伍辛夷的湯劑或者制劑治療鼻炎或者變應(yīng)性疾病，而且其治療療效得到了肯定[8-10]。藥對(duì)是溝通單藥與復(fù)方中藥的橋梁，以藥對(duì)為研究對(duì)象，可以避免復(fù)方中成分、劑量、炮制方法等復(fù)雜的問(wèn)題[11]。蒼耳子－辛夷是經(jīng)典的藥對(duì)，研究發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)揮發(fā)油可明顯抑制皮膚的過(guò)敏反應(yīng)[12]，可減輕AR豚鼠鼻黏膜病理變化，改善鼻部行為學(xué)癥狀[13]。研究證實(shí)蒼耳子配伍辛夷可以增強(qiáng)抗炎作用，并降低蒼耳子的毒性作用[3，4]，但其治療AR的主要活性成分和分子機(jī)制尚未完全闡明。為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)更好的推廣，研制新藥，減輕疾病負(fù)擔(dān)，故開(kāi)展此研究。

隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者采用現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)從基因表達(dá)、蛋白質(zhì)修飾、分子通路等方面解釋中醫(yī)藥相互配伍治療疾病的作用機(jī)理[14]。由于中藥材的多組分、多靶點(diǎn)、多通道的特點(diǎn)，其作用機(jī)制的確定比較困難。本研究從蛋白質(zhì)相互作用、GO與KEGG富集分析等方面分析了蒼耳子配伍辛夷治療AR的藥理活性成分和可能的分子網(wǎng)絡(luò)，以探討兩者配伍在A(yíng)R治療中的潛在作用機(jī)制。首先通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法和技術(shù)，構(gòu)建了不同層次的網(wǎng)絡(luò)，如藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、KEGG通路富集分析等，然后對(duì)上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較分析。通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用分子網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)中心度較高的靶點(diǎn)有CASP3、CASP9、BCL2、ESR1、MYC、GSK3B等，其中CASP3、CASP9是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族成員，參與炎癥的調(diào)節(jié)和細(xì)胞的凋亡，起到了重要的抗炎作用[15，16]。ESR1激活后能減少炎癥介質(zhì)的生成從而抑制炎癥反應(yīng)，研究表明其他的類(lèi)固醇激素受體，如：糖皮質(zhì)激素、雄激素，在治療鼻炎中也起到了重要作用[17，18]。此外，BCL2是一種凋亡抑制因子，研究證實(shí)氣道炎癥模型中，BCL2蛋白在鼻黏膜、肺等組織的炎癥細(xì)胞中表達(dá)增高，而B(niǎo)cl-2抑制劑可以有效減少嗜酸性粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)[19]，全基因組關(guān)聯(lián)研究確定了MYC為致敏的重要基因之一[20]。

蒼耳子配伍辛夷抗AR是多靶點(diǎn)、多通路相互作用和相互影響的結(jié)果。通過(guò)AR相關(guān)靶點(diǎn)的GO富集分析，發(fā)現(xiàn)蒼耳子配伍辛夷抗AR涉及的生物學(xué)過(guò)程可能與細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡通路以及細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)有關(guān)，已有研究證實(shí)上述生物學(xué)過(guò)程參與了抗AR作用[21，22]。蒼耳子配伍辛夷抗AR涉及的分子功能主要富集于核因子、轉(zhuǎn)錄因子、類(lèi)固醇激素、神經(jīng)遞質(zhì)等受體活性的調(diào)節(jié)。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，蒼耳子配伍辛夷抗AR作用可能與多條信號(hào)通路有關(guān)，涉及PI3K-Akt、甲狀腺激素、細(xì)胞凋亡信號(hào)、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乙型肝炎等相關(guān)信號(hào)通路。AR屬于IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)，與眾多Th2細(xì)胞因子（如:IL-4、IL-5、TL-6、TNF）以及這些因子所介導(dǎo)的炎癥通路有關(guān)[23]。兩種藥物抗過(guò)敏、抗炎的靶標(biāo)也表達(dá)于抗癌通路中，研究證實(shí)AR的發(fā)病率與乙型肝炎攜帶者呈正相關(guān)，可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)控IL-10等抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)而下調(diào)Th1和Th2應(yīng)答有關(guān)[24]。而AR、哮喘的發(fā)病率與癌癥的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，研究學(xué)者推測(cè)可能是IgE介導(dǎo)的反應(yīng)發(fā)揮了免疫監(jiān)視的重要作用，其次，嗜酸性粒細(xì)胞可能具有重要的抗腫瘤作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號(hào)通路參與基因最多，共6個(gè)，且可信度較高，研究證實(shí)PI3K-Akt信號(hào)通路可抑制肥大細(xì)胞的活化和增強(qiáng)抗炎因子的表達(dá)從而發(fā)揮抗AR作用[21，26]。

綜上所述，蒼耳子配伍辛夷能夠調(diào)控以CASP3、CASP9、BCL2、MYC、ESR1、MYC等基因?yàn)橹行牡姆肿泳W(wǎng)絡(luò)，具體機(jī)制可能與PI3K-Akt、甲狀腺激素、細(xì)胞凋亡信號(hào)、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乙型肝炎等相關(guān)通路間的相互作用有關(guān)，為進(jìn)一步驗(yàn)證蒼耳子配伍辛夷抗AR的有效成分，并闡明其作用機(jī)制提供了新的思路和切入點(diǎn)。未來(lái)研究需要以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果為導(dǎo)向，通過(guò)進(jìn)一步研究進(jìn)行驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上研發(fā)新的治療AR的藥物。