顧 云 張立霞 李淑珂

1 蓬萊區(qū)人民醫(yī)院 山東 蓬萊 265600；2 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003； 3 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院 山東 煙臺(tái) 264100

流式細(xì)胞分選技術(shù)是利用流式細(xì)胞儀，以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將目的細(xì)胞群分選出來。相對(duì)于機(jī)械法、免疫磁珠法、單細(xì)胞捕獲法等傳統(tǒng)細(xì)胞分離手段，具有分選參數(shù)多、分選群體多、分選純度高、靈活性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[1]，目前越來越多的實(shí)驗(yàn)涉及到流式分選，分選顆粒種類也越來越多，有動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞[2-5]、微生物[6-8]及人工合成微粒等。要得到一個(gè)好的分選結(jié)果，在做流式分選的時(shí)候，不但要注意分選方案的選擇、初始細(xì)胞狀態(tài)、接收管處理等因素[9]，噴嘴的選擇也是影響分選結(jié)果的一個(gè)重要因素。目前常用的噴嘴型號(hào)有70、85、100、120等，研究用70，100兩種不同型號(hào)的噴嘴，觀察噴嘴對(duì)不同大小的顆粒、不同的熒光染色實(shí)驗(yàn)分選的影響。

1 實(shí)驗(yàn)試劑、分組與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 BDAria III流式細(xì)胞儀(BD公司，P64828200134)。

1.2 分選顆粒 BD Calibiite Bead(BD公司，23-3171-07)，Thp-1、H6和人外周血單核細(xì)胞(濱州醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng))。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 人CD41-PE(BD公司，563562)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(BD公司，556547)，Drop Delay Bead(BD公司，5271955)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 BD Calibiite Bead組：選取BD Calibiite Bead中的U，Apc和PE三種熒光微球各100 μL加至3 mL磷酸鹽緩沖液中。

Thp-1組：計(jì)數(shù)5×106個(gè)Thp-1細(xì)胞，放至60℃水中20 min造成細(xì)胞損傷，5 μL Annexin V-FITC和5ul PI染色20 min。

H6組：計(jì)數(shù)5×106個(gè)H6細(xì)胞，放至60℃水中20 min造成細(xì)胞損傷，Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL染色20 min。

人外周血單核細(xì)胞組： 全血溶紅，淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，加人CD14-PE 5 μL染色30 min。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用χ2檢驗(yàn)分析定性資料，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 分選條件 分選條件調(diào)節(jié)(表1)，分選模式選擇純度模式(Purity)。

表1 70、100噴嘴的分選條件

2.2 四組樣本分別進(jìn)行流式分選 使用70、100兩種不同型號(hào)的噴嘴，觀察上樣時(shí)液流的穩(wěn)定性，包括側(cè)液流的連續(xù)性、是否出現(xiàn)斷流情況、Gap值的變化、正液流的分選點(diǎn)的穩(wěn)定性。

收集所選門內(nèi)的顆粒，將收集的顆粒進(jìn)行流式檢測(cè)，觀察顆粒的位置的變化及檢測(cè)流式的分選純度。BD Calibiite Bead組分別收集PE陽性微球和APC陽性微球，Thp-1組收集Annexin V-FITC和PI雙陽性細(xì)胞，H6組收集Annexin V-FITC和PI雙陽性細(xì)胞，人外周血單核細(xì)胞組收集人CD14-PE陽性細(xì)胞。

單核細(xì)胞組PI染色，觀察單核細(xì)胞組分選后的細(xì)胞活性。

3 結(jié)果

3.1 不同組分別用70、100的噴嘴進(jìn)行分選時(shí)的液流穩(wěn)定性 分選液流穩(wěn)定為“+”，出現(xiàn)管路堵塞、液流中斷；Gap值變化頻繁，上下液滴間移動(dòng)；正液流中的分選點(diǎn)不穩(wěn)定為“-” 。

3.2 不同組分別用70、100的噴嘴進(jìn)行分選情況 與70噴嘴相比，100噴嘴的分選純度BD Calibiite Bead-PE組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Thp-1細(xì)胞組、H6細(xì)胞組、人單核細(xì)胞組分選純度高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1，表2)。

圖1 不同組分選后的純度的變化

表2 不同組分選后的純度(n=5，%)

3.3 分選后人外周血單核細(xì)胞的活性 人外周血單核細(xì)胞用70噴嘴和100噴嘴分選后細(xì)胞活性都在90%以上，用100噴嘴分選活性較70噴嘴高(圖2)。

圖2 人外周血單核細(xì)胞分選后細(xì)胞活性

4 討論

流式分選效果同流式細(xì)胞儀的機(jī)型，機(jī)器的維護(hù)，噴嘴的選擇，分選條件的選擇均有關(guān)系[10-12]。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選時(shí)，細(xì)胞大小不超過噴嘴孔徑的五分之一，絕不超過三分之一。所以我們?cè)谶M(jìn)行細(xì)胞分選時(shí)就要有所選擇，像直徑較小的細(xì)胞或人工合成微粒，熒光抗體結(jié)合較穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)可以選擇小孔徑的噴嘴，因?yàn)樾】讖降膰娮旆诌x速度更快，分選純度也很好。對(duì)于干細(xì)胞、神經(jīng)元、粒細(xì)胞這些脆弱或易激惹的細(xì)胞，要選用對(duì)細(xì)胞損傷相對(duì)較小的大孔徑的噴嘴。

細(xì)胞凋亡染色后分選，分選純度均不高，熒光素FITC、PI的平均熒光強(qiáng)度均有所降低，考慮在分選過程中，特別是打入接收管的過程中造成了結(jié)合在細(xì)胞表面的抗體脫落，像這種結(jié)合較不穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行分選時(shí)最好選用大孔徑噴嘴，最低速度分選。

在合理使用噴嘴的同時(shí)做好噴嘴的護(hù)理。噴嘴在使用前和使用后均要置于純水中進(jìn)行常規(guī)的超聲，以防止鞘液或分選顆粒黏貼至噴嘴“o”圈的內(nèi)側(cè)造成液流不穩(wěn)。但超聲時(shí)間盡量不要超過30 min鐘，超聲后放置于噴嘴架上晾干，不要長時(shí)間超聲或放置于純水中，否則容易造成噴嘴上“o”圈的脫落。如果“o”圈脫落，可以購置單獨(dú)的“o”圈，在每次分選前用扁頭棉簽沾水將其放置在噴嘴原位置使用。