丁瑞松 胡 雯 黃盼盼 胡 濤

濱州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 山東 煙臺(tái) 264003

間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞(mesenchymal stromal cells，MSCs)可從骨髓、臍帶、脂肪、牙齦、胎盤和其他組織中分離和擴(kuò)增[1]，具有自我更新和多向分化潛能。人胎盤源MSCs(human placenta derived mesenchymal stromal cells, hPMSCs)源于足月胎盤組織，是經(jīng)人工培養(yǎng)擴(kuò)增的、未分化的間充質(zhì)樣細(xì)胞。這些細(xì)胞既具有MSC的特征，也具有與胎盤來(lái)源相關(guān)的獨(dú)特表型[2-4]。根據(jù)培養(yǎng)條件不同可定向分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞[5]。MSCs具有很高的生長(zhǎng)可塑性，可用于組織再生和造血干細(xì)胞移植[6-7]及一系列急慢性疾病治療[5,8-9],諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮膚創(chuàng)傷和肝病[10-13]。

在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，抗原提呈細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞之間的相互作用，影響免疫記憶的產(chǎn)生和宿主的免疫穩(wěn)態(tài)[14]。MSCs可通過(guò)多種方式調(diào)控T、B淋巴細(xì)胞的激活及功能參與調(diào)節(jié)[15]。其中，骨髓來(lái)源的MSCs可以通過(guò)分泌TGF-β、IFN-γ、IL-6、IL-10或表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)來(lái)促進(jìn)T細(xì)胞向Treg方向分化[16-17]。hPMSCs能通過(guò)抑制T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡，改善與治療GVHD[18]；也可通過(guò)上調(diào)外周血中的Treg細(xì)胞、促進(jìn)成纖維細(xì)胞樣的滑膜細(xì)胞、脾細(xì)胞增殖、改善細(xì)胞因子分泌模式調(diào)節(jié)小鼠關(guān)節(jié)炎[19-20]。就T細(xì)胞而言，其成熟、分化及針對(duì)絲裂原的刺激反應(yīng)均伴隨糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶及相應(yīng)產(chǎn)物的改變[21]。T細(xì)胞自身O-糖基化的動(dòng)態(tài)變化既可調(diào)控不同階段T細(xì)胞的發(fā)育，又可影響T細(xì)胞歸巢的信號(hào)通路。O-糖基化的關(guān)鍵酶(T-synthase，T-合酶)活性也可調(diào)控胸腺細(xì)胞的成熟過(guò)程。由于T-合酶活性受控于其特定的分子伴侶(core 1 β3-Gal-T-specific molecular chaperone，Cosmc)，所以Cosmc缺失會(huì)導(dǎo)致外周淋巴系統(tǒng)中T細(xì)胞大量丟失[22]。為研究O-糖基化的變化過(guò)程，研究者將人類淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat T細(xì)胞，作為理想模型[23]。該細(xì)胞Cosmc基因突變導(dǎo)致O-糖基化異常，僅表達(dá)O-糖基化的中間產(chǎn)物Tn抗原(galNAC-α-O-Ser/Thr，CD175)。Tn抗原可以在T-合酶的作用下，進(jìn)一步連接半乳糖(gal)、N-乙酰葡萄糖胺(glcNAC)形成更為復(fù)雜的O-糖鏈結(jié)構(gòu)。這些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)。隨著新型細(xì)胞O-糖組檢測(cè)技術(shù)(Cellular O-glycome Reporter/Amplifition，CORA)[23]的開發(fā)應(yīng)用，研究者可以更容易、更準(zhǔn)確地分析O-糖組的變化，O-糖基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展及免疫細(xì)胞表型改變中的作用也成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

基于此，本研究將hPMSCs與 Jurkat T細(xì)胞共培養(yǎng)，采用FCM檢測(cè)共培養(yǎng)前后Jurkat T表面標(biāo)記分子CD4、CD28、CD175的表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)Cosmc蛋白，熒光法檢測(cè)T-合酶活性，CORA檢測(cè)O-糖組變化，探究hPMSCs對(duì)Jurkat T表面CD分子表達(dá)的影響及機(jī)制，以期為hPMSCs用于人類淋巴細(xì)胞白血病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；流式細(xì)胞儀(Cytoflex，美國(guó)Beckman Coulter公司)；SDS-PAGE電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(英國(guó)Chenis Cop公司)；Moldi-TOF質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent Technologies公司)。

1.1.2 藥品與試劑 小鼠抗人Tn抗原單克隆抗體(anti-CD175，美國(guó)埃默里大學(xué)巨同忠博士惠贈(zèng))；羊抗鼠IgM-APC(美國(guó)Santa Cruze公司)；CD73-FITC、CD44-FITC、CD90-FITC、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE(美國(guó)Invitrogen公司)；CD4-PE、CD28-PerCP(美國(guó)Biolegend公司)。小鼠抗人單克隆抗體(anti-Cosmc，anti-α-Tubulin)(美國(guó)Proteintech Group公司)。

1.1.3 hPMSCs 由本室從健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦胎盤分離；人白血病細(xì)胞株Jurkat T(Clone E6-1，CL-0129)購(gòu)于中國(guó)武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hPMSCs的分離、培養(yǎng) 經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，產(chǎn)婦知情同意后，無(wú)菌采集其足月剖宮產(chǎn)后胎盤。胎盤離體后立即低溫儲(chǔ)存送往實(shí)驗(yàn)室，用含1%雙抗D-Hanks液沖洗胎盤組織，剪去胎盤的蛻膜組織后剪碎；Ⅳ型膠原蛋白酶消化。參考相關(guān)文獻(xiàn)[24]稍加改良，于6小時(shí)內(nèi)分離出hPMSCs接種到6孔板中(細(xì)胞的密度1×108/孔)，37℃培養(yǎng)20天左右進(jìn)行第一次細(xì)胞傳代(期間，每隔4天進(jìn)行半量換液，經(jīng)3次半量換液后進(jìn)行首次全量換液)；培養(yǎng)3～5代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞共培養(yǎng) 將2×106hPMSCs接種后培養(yǎng)12 h，加入1×106Jurkat T細(xì)胞，DMEM(10%胎牛血清，100 μmol/L青霉素、鏈霉素)培養(yǎng)48 h，分別收集Jurkat T及hpMSCs細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 hPMSCs成脂、成骨分化鑒定 將培養(yǎng)至第3代的hPMSCs接種于12孔板(5×104/孔)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)85%～90%后，對(duì)hPMSCs進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化鑒定。每孔用1.5mL完整的MesenCultTM成脂分化培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基。每3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至15天棄掉培養(yǎng)基，通過(guò)油紅O染色觀察hPMSCs成脂分化情況。成骨分化方法同成脂分化，采用MesenCultTM成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞15天后，茜素紅S染色觀察分化情況。

1.2.4 hPMSCs表型鑒定 hPMSCs培養(yǎng)至第5代，收集細(xì)胞，加入熒光抗體(鼠抗人FITC-IgG1、PE-IgG2b、FITC-CD73、FITC-CD90、FITC-CD44、PE-CD34、PE-CD45、PE-HLA-DR)，4℃避光孵育30 min；4℃離心(1 000 r/min，5 min)，洗去未結(jié)合抗體。PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.5 細(xì)胞表面CD4、CD28、CD175分子的檢測(cè) 分別收集共培養(yǎng)前后的hPMSCs及Jurkat T細(xì)胞，分別加入CD4-PE、CD28-PerCP、CD175-APC，4℃避光孵育30 min；離心洗去未結(jié)合的抗體。400 μL PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 胞漿蛋白提取 收集共培養(yǎng)前后的Jurkat T細(xì)胞于干凈預(yù)冷的1.5 mL EP管中，加入預(yù)冷的細(xì)胞質(zhì)提取試劑I 200 μL(CERⅠ 198 μL+蛋白酶抑制劑2 μL)，渦旋振蕩15 s，冰上孵育10 min；再加入預(yù)冷的裂解液CERⅡ 11 μL，渦旋振蕩5s，充分混勻后于冰上孵育1 min。16 000 g，5 min，4℃離心，收集上清(胞漿蛋白，定量)至預(yù)冷的1.5 mL EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 總蛋白提取 收集共培養(yǎng)前后的Jurkat T細(xì)胞于干凈預(yù)冷的1.5 mL EP管中，向每管細(xì)胞中加入預(yù)冷的150 μL裂解液(RIPA∶PFSM=100∶1)后渦旋15 s，冰上孵育30 min。16 000 g，5 min，4℃離心，收集上清至預(yù)冷的EP管中，蛋白定量后置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 T-合酶活性測(cè)定 UDP-Gal作為供體，GalNAc-α-(4-MU)為受體，采用熒光法檢測(cè)T-合酶的活性[48]。50 μL反應(yīng)體系(成分見表1)，混勻后加入到96孔黑板中， 37℃孵育60 min。取出96孔黑板，每孔中加入100 μL NaOH-Gly溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在Ex=355 nm，Em=460 nm處的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)樣品的T-synthase活性。

表1 反應(yīng)體系成分

1.2.9 Western blot 將蛋白上清與6×蛋白上樣緩沖液按照5∶1體積比加入到EP管中，混勻后置于金屬浴中，95℃，10 min。20 μg蛋白經(jīng)PAGE電泳轉(zhuǎn)移至再將PVDF膜，加入相應(yīng)的一抗(α-Tubulin為1∶10 000，Cosmc為1∶500)于4℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫下?lián)u床孵育120min。洗滌4次，加入發(fā)光液；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光、拍照。

1.2.10 質(zhì)譜檢測(cè)細(xì)胞O-糖組結(jié)構(gòu) 細(xì)胞共培養(yǎng)至48 h后棄去原培養(yǎng)基，加入4 μL 50 μM Bn-α-GalNAc，對(duì)照組每孔加入4 μL DMSO，培養(yǎng)3天；按文獻(xiàn)表述方法收集細(xì)胞培養(yǎng)上清[48]，經(jīng)C18 Sep-Pak柱吸附、洗脫獲取O-聚糖，質(zhì)譜儀分析O-糖鏈結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 23.0軟件和GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPMSCs的表型鑒定及誘導(dǎo)分化 原代hPMSCs傳代培養(yǎng)至第3代后，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，漩渦狀生長(zhǎng)(圖1A)。在誘導(dǎo)成脂及成骨細(xì)胞分化的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天后，成脂分化的hPMSCs中可見鮮紅色脂滴(圖1B)，成骨分化的hPMSCs中可見紅色鈣化小結(jié)(圖1C)。hPMSCs傳代培養(yǎng)至第5代，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定免疫表型，結(jié)果顯示，hPMSCs高表達(dá)CD73、CD90和CD44，幾乎不表達(dá)CD45、CD34及HLA-DR(圖1D)；具有典型的MSCs特征。

A.第3代hPMSCs形態(tài)(100×);B.油紅O染色示hPMSCs成脂分化(400×);C.茜素紅染色示hPMSCs成骨分化(400×);D.流式細(xì)胞儀示hPMSCs表面免疫表型。

2.2 hPMSCs對(duì)Jurkat T細(xì)胞表面CD分子表達(dá)的影響 Jurkat T細(xì)胞表面低表達(dá)CD4分子(平均熒光強(qiáng)度為2 136.3±121.8)，高表達(dá)CD28和CD175分子(平均熒光強(qiáng)度分別為56 858.8±720.1，78 325.7±140.9)。與hPMSCs共培養(yǎng)后Jurkat T細(xì)胞表面CD4分子表達(dá)升高(平均熒光強(qiáng)度為4 151.2±213.4)，CD28和CD175分子表達(dá)降低(平均熒光強(qiáng)度分別為34 895.2±410.4，21 790.6±718.1)。見圖2。

A,B.hPMSCs上調(diào)Jurkat T細(xì)胞表面CD4分子的表達(dá)；C,D.hPMSCs下調(diào)Jurkat T細(xì)胞表面CD28分子的表達(dá)；.E,F.hPMSCs下調(diào)Jurkat T細(xì)胞表面CD175分子的表達(dá)，***P<0.001。

2.3 hPMSCs升高Jurkat T細(xì)胞T-合酶活性及Cosmc蛋白 前期研究發(fā)現(xiàn)Cosmc突變導(dǎo)致Tn抗原(CD175)表達(dá)。本研究顯示，共培養(yǎng)后Jurkat T細(xì)胞T-合酶活性增高(圖3A)；Western blot顯示Cosmc蛋白表達(dá)升高(圖3B)。提示hPMSCs可通過(guò)改變Cosmc蛋白水平，影響T-合酶活性。

A.與hPMSCs共培養(yǎng)前后Jurkat T細(xì)胞T-合酶活性變化；B.與hPMSCs共培養(yǎng)前后Jurkat T細(xì)胞Cosmc的蛋白表達(dá)情況。***P<0.001。

2.4 hPMSCs改變Jurkat T細(xì)胞O-糖組結(jié)構(gòu) O糖基化異常導(dǎo)致Tn抗原(CD175)表達(dá)；hPMSCs可抑制Jurkat T細(xì)胞表面CD175分子的表達(dá)。CORA結(jié)果顯示，hPMSCs表達(dá)核心1和核心2來(lái)源的O-聚糖結(jié)構(gòu)，核心1 O-聚糖結(jié)構(gòu)(m/z：955.4、1 129.5、1 316.6)；核心2 O-聚糖結(jié)構(gòu)(m/z：1 217.6、1 648.7、1 782.8、1 939.9、2 058.0、2 563.2)(圖4A)。Jurkat T組細(xì)胞無(wú)核心1及核心2來(lái)源的O-聚糖結(jié)構(gòu)，但與hPMSCs共培養(yǎng)后出現(xiàn)核心1來(lái)源的 O-聚糖結(jié)構(gòu)(m/z：955.4、1 316.6)(圖4B)。

A.hPMSCs中核心1和核心2來(lái)源的O-聚糖；B.共培養(yǎng)前后Jurkat T細(xì)胞O-聚糖結(jié)構(gòu)。

3 討論

O-糖基化是最常見的蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾的形式之一。在白細(xì)胞表面已鑒定出的200多種不同蛋白質(zhì)中，幾乎所有蛋白質(zhì)都會(huì)經(jīng)過(guò)糖基化修飾。大多數(shù)糖蛋白以特征性的糖基化模式在每個(gè)糖基化位點(diǎn)、以聚糖異質(zhì)群體的形式出現(xiàn)。T細(xì)胞參與抗原識(shí)別以及在隨后的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程多以受體配體相互結(jié)合發(fā)揮作用；而大多數(shù)受體是糖蛋白[26]。Cosmc作為T-合酶的分子伴侶促使T-合酶正確盤曲折疊，發(fā)揮正常的生物活性；具有正常生物學(xué)活性的T-合酶將UDP-Gal上的半乳糖連接到CD175分子(Tn抗原)上形成核心1結(jié)構(gòu)(Galβ1,3GalNAc-α-O-Ser/Thr)的O-聚糖，才能使糖鏈進(jìn)一步的正確延伸[25]；結(jié)構(gòu)復(fù)雜的O-糖鏈在免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。

研究認(rèn)為，MSCs具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性；在多系分化[27]、免疫抑制[28]、抗纖維化[28]、抗凋亡[29]等方面也具有極其重要的作用。因此，研究人員試圖證明基于胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞療法對(duì)各種疾病具有適度的療效[30-32]。在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的幾個(gè)關(guān)鍵步驟中，MSCs可以對(duì)T細(xì)胞發(fā)揮抑制作用，包括T細(xì)胞亞群的存活、激活和分化；并可通過(guò)多種方式誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。例如，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過(guò)依賴于FasL的凋亡途徑誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡[33]。與靜息的T細(xì)胞相比，活化的T細(xì)胞對(duì)MSC誘導(dǎo)的凋亡更敏感。這可以歸因于促炎因子刺激的MSCs中高水平的吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)表達(dá)所催化的色氨酸耗竭和色氨酸代謝物的產(chǎn)生[33]。在小鼠MSCs中也觀察到了類似的T細(xì)胞活性抑制[34]。然而，這些研究并未涉及幼稚的白血病細(xì)胞Jurkat T表面CD分子的變化是否受hPMSCs的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，hPMSCs能夠?qū)urkat T細(xì)胞表面CD分子的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響，與hPMSCs共培養(yǎng)后的Jurkat T細(xì)胞表面CD4分子表達(dá)降低，CD28和CD175分子表達(dá)降低(圖2)。由于B7/CD28結(jié)合是T細(xì)胞活化的重要信號(hào)，促進(jìn)抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)，有助于T細(xì)胞的活化、增殖分化，所以Jurkat T細(xì)胞表面CD28的下調(diào)，提示hPMSCs可抑制Jurkat T細(xì)胞增殖。再者，CD4表達(dá)水平的增高，可以預(yù)示T細(xì)胞的進(jìn)一步成熟。

值得注意的是，CD175被視為多種腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)；Jurkat T細(xì)胞表面高表達(dá)CD175亦決定了其惡性特征。與hPMSCs共培養(yǎng)后，Jurkat T細(xì)胞表面CD175表達(dá)受抑，并出現(xiàn)共培養(yǎng)前Jurkat T細(xì)胞不具有的O-糖基化結(jié)構(gòu)，核質(zhì)比為955.4(gal-galNAC)和1 316.6(Sialy-gal-galNAC)的核心1來(lái)源的O-聚糖；提示hPMSCs可促進(jìn)Jurkat T細(xì)胞O-糖鏈的延伸，進(jìn)而影響Jurkat T細(xì)胞的惡性行為。

hPMSCs具有復(fù)雜的O-聚糖結(jié)構(gòu)，表達(dá)核心1(m/z：955.4、1 129.5、1 316.6)和核心2(m/z：1 217.6、1 648.7、1 782.8、1 939.9、2 058.0、2 563.2)來(lái)源的O-聚糖結(jié)構(gòu)。與hPMSCs共培養(yǎng)后，Jurkat T細(xì)胞表面CD4、CD28及CD175變化應(yīng)與其O-糖基化程度有關(guān)；Jurkat T細(xì)胞的核心1衍生型O-聚糖結(jié)構(gòu)與hPMSCs上的部分糖結(jié)構(gòu)相一致(圖4.A)可歸因于Cosmc及T-合酶活性的升高。因此，有理由推測(cè)，共培養(yǎng)后，Jurkat T細(xì)胞中的Cosmc可能來(lái)源于hPMSCs的外泌體或者分泌的囊泡，Cosmc蛋白促進(jìn)了T-合酶活性的增高。這種推測(cè)或許需要后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)hPMSCs對(duì)白血病細(xì)胞Jurkat T表面CD分子的調(diào)節(jié)受控于O-糖基化。hPMSCs可通過(guò)上調(diào)Cosmc蛋白、T-合酶活性改變Jurkat T細(xì)胞O-糖基化狀態(tài)影響其表面CD4、CD28及CD175表達(dá)。