常金圓，李淏，江正龍，馮利

1.國家癌癥中心／國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心／中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院，北京 100021；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029

疼痛是癌癥診斷中最為常見的表現(xiàn)特征，同時也是癌癥患者在整個疾病過程中最為恐懼的癥狀。大約45%的癌癥晚期患者經(jīng)歷了中、重度疼痛［1］，然而在臨床中這類疼痛往往是難以緩解的［2］。因其發(fā)生機制過于復雜，導致治療方法局限，治療效果欠佳。目前臨床普遍應用WHO“三階梯止痛療法”治療癌性疼痛，然而其帶來的不良反應通常導致患者難以持續(xù)接受治療［3－4］。中醫(yī)將其歸于“痛證”范疇，究其病機不外乎“不通則痛”及“不榮則痛”兩端。癌毒與痰瘀互結，發(fā)為癌腫，導致脈絡閉阻，發(fā)為疼痛，此為不通則痛；日久邪傷正氣，氣血虛弱，導致無法濡養(yǎng)臟腑經(jīng)絡，發(fā)為疼痛，此為不榮則痛。

少腹逐瘀湯出自王清任《醫(yī)林改錯》一書，由當歸、川芎、小茴香、干姜、延胡索、沒藥、肉桂、赤芍、蒲黃、五靈脂10味藥組成，具有養(yǎng)血活血、通利血脈、溫經(jīng)散寒、理氣除濕、化瘀止痛的作用。臨床普遍應用于婦科及男科疾病的治療［5］，因其化瘀通利的特性，故而在治療腫瘤相關病癥方面也有獨特的作用。相關實驗結果表明，經(jīng)少腹逐瘀湯干預后，可使模型大鼠體內白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）及腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNFα）水平降低，抑制炎性介質合成和釋放，提高機體免疫力［6］。醋酸扭體實驗和棉球肉芽腫實驗結果顯示，少腹逐瘀湯能明顯抑制醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)，表明其對炎性疼痛具有一定的抑制作用［7］。中藥復方因其多中藥、多成分、多靶點協(xié)同的特點，應用目前現(xiàn)有的研究手段，通常不能全面解釋其作用。網(wǎng)絡藥理學從宏觀、系統(tǒng)的角度，探尋藥物治療疾病的整體效應，打破了以往單化合物、單靶點的研究模式，為研究中藥復方提供了新的思路。

1 資料與方法

1.1 少腹逐瘀湯活性成分和相關靶點篩選本研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）及BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫（http：／／bionet.ncpsb.org／batman－tcm／）構建少腹逐瘀湯化學成分數(shù)據(jù)庫。TCMSP數(shù)據(jù)庫所含中藥：依據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18為條件，篩選其活性成分［8］，及有效化合物相關的靶點。非TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥：通過BATMAN－TCM數(shù)據(jù)庫查詢中藥相關活性成分，并設定評分＞20，作為活性靶點的篩選依據(jù)［9］。并將靶點通過uniprot數(shù)據(jù)庫（https：／／www.uniprot.org）進行標準化。

1.2 癌性疼痛相關靶點預測以“cancer－related pain”為檢索詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫［10］（https：／／www.GeneCards.org／）查詢癌性疼痛相關靶點。

1.3 少腹逐瘀湯中藥－活性化合物－靶點網(wǎng)絡構建將藥物－疾病交集靶點以及藥物活性化合物導入Cytoscape3.7.2中［11］，繪制少腹逐瘀湯與癌性疼痛中藥－活性化合物－靶點網(wǎng)絡圖。

1.4 少腹逐瘀湯化學成分靶點蛋白互作（proteinprotein interaction，PPI）及Hub基因網(wǎng)絡的構建將交集靶點上傳到String11.0數(shù)據(jù)庫中（https：／／www.string－db.org），選擇物種為人源，最低相互作用閾值設定為0.9，證據(jù)類型設置為來源于實驗、數(shù)據(jù)庫以及共表達，建立PPI網(wǎng)絡。并將網(wǎng)絡導入Cytoscape3.7.2軟件，應用Cytohubba插件［12］，計算網(wǎng)絡中各節(jié)點的最大中心性MCC值，繪制Hub基因網(wǎng)絡圖。

1.5 少腹逐瘀湯對癌性疼痛作用靶點生物功能注釋分析將交集得到的靶點，利用Bioconductor中的R包clusterprofile v3.12.0，設定P＜0.05，進行GO富集分析及KEGG富集分析［13］。

1.6 少腹逐瘀湯治療癌性疼痛的分子對接驗證通過PDB數(shù)據(jù)庫（https：／／www.rcsb.org）下載蛋白結構，并將其導入對接模擬軟件AutoDock，與Degree值排名前5位的關鍵藥效分子進行對接模擬計算，并以靶點蛋白相應的配體作為陽性對照。完成對接模擬之后，根據(jù)關鍵藥效分子和靶點蛋白最強親和力值繪制熱圖。并篩選結合最穩(wěn)定的對接結構，利用ligplot繪制對接模式圖。

2 結果

2.1 少腹逐瘀湯與癌性疼痛靶點全局性網(wǎng)絡分析共收集到化合物1 219種，依據(jù)篩選條件進行篩選，刪重后共有139種，藥物靶點344個，疾病相關靶點906個，其中藥物與疾病相同靶點104個（圖1A）。通過Cytoscape 3.7.2構建中藥－活性化合物－靶點作用網(wǎng)絡圖，通過network analyze計算網(wǎng)絡的拓撲學參數(shù)，結果一共得到204個節(jié)點，854條邊。按照Degree值對活性化合物進行排序，得到排名前5位的化合物為槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、β－谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）、益母草素（MOL004215）（圖1B）。排名前5位的活性化合物與疾病靶點相互作用見圖1C。提示在應用少腹逐瘀湯治療癌性疼痛中，這些化合物具有關鍵作用。

圖1 少腹逐瘀湯與癌性疼痛靶點全局性網(wǎng)絡分析示意圖

2.2 少腹逐瘀湯治療癌性疼痛核心靶點分析將104個交集靶點上傳到String11.0數(shù)據(jù)庫，建立PPI網(wǎng)絡，共得到74個節(jié)點，234條邊（圖2A）。為了進一步探求PPI網(wǎng)絡中核心蛋白之間的相互作用關系，應用cytohubba插件，計算網(wǎng)絡中各節(jié)點的最大中心性MCC值，并繪制Hub基因網(wǎng)絡圖（圖2B）。其中ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、CHRM2及AVP的MCC值較高。

圖2 少腹逐瘀湯治療癌性疼痛核心靶點分析圖

2.3 少腹逐瘀湯對癌性疼痛作用靶點的GO分析和KEGG分析利用R包clusterprofile一共得到GO條目1 718條，主要富集在調節(jié)神經(jīng)元動作電位以及炎癥的發(fā)生（表1）。KEGG富集顯示，少腹逐瘀湯通過調節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）信號通路、核因子κB亞單位（nuclear factor kappa B subunit，NF－kappa B）信號通路以及瞬時受體電位信號通路，達到治療癌痛的作用。見表2。

表1 少腹逐瘀湯生物學功能富集結果

表2 少腹逐瘀湯KEGG富集結果

2.4 少腹逐瘀湯治療癌性疼痛分子對接結果驗證對12個關鍵靶蛋白及5個關鍵化合物分子對接的最低結合能做熱圖（圖3）。由圖3所示，所有分子與靶標蛋白的最低結合能均小于－1.2 kcal·mol－1，說明所有活性化合物與受體均能結合。其中CHRM2、F2R、P38及TNF－α結合最緊密。靶點蛋白基本信息見表3。

表3 靶點蛋白基本信息表

圖3 分子對接結果熱圖

為了進一步探究CHRM2、F2R、P38及TNF－α與化合物的結合模式，選取各自對接最穩(wěn)定的結構進行模擬分析，其中，CHRM2與β－谷甾醇結合最緊密，F(xiàn)2R、P38和TNF－α與豆甾醇結合最緊密（圖4）。

圖4 對接結果模式圖

結果表明，小分子化合物和蛋白靶點均可通過形成疏水作用以及范德華力從而形成穩(wěn)定結合，其中，豆甾醇還可以與F2R和TNF－α分別在Leu40和Glu110殘基位點上形成氫鍵，與P38在Glu81以及Asn82殘基位點上形成氫鍵，從而增強結合的穩(wěn)定性。

3 討論

少腹逐瘀湯是治療婦科瘀血內阻的代表方之一，將此方加減后應用于癌性疼痛的治療，是取此方溫經(jīng)散寒、化瘀止痛之功用，同時也符合腫瘤發(fā)生的中醫(yī)病機［14］。癌性疼痛的發(fā)病機制尚未明確，包含了神經(jīng)病理痛和炎性疼痛的特性，但其機制遠比以上兩種疼痛復雜，對機制研究的不足也是限制癌性疼痛治療效果的原因之一。西醫(yī)治療手段和靶點相對單一，針對癌痛多靶點的特性，中藥復方多靶點、多成分協(xié)同作用，使得臨床中應用少腹逐瘀湯治療癌性疼痛往往頗有療效。

研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇、豆甾醇及益母草素的Degree值高于其余成分，說明這些藥物成分可能是少腹逐瘀湯治療癌性疼痛的關鍵成分。槲皮素及山柰酚均屬于黃酮類化合物。有研究發(fā)現(xiàn)，兩者均可影響細胞因子的分泌，快速清除DPPH和ABTS自由基，有效抑制TNF－α的分泌［15］；β－谷甾醇及豆甾醇都屬于植物甾醇類成分，兩者均有抗腫瘤及抗炎作用。有研究發(fā)現(xiàn)，β－谷甾醇通過減少NO的合成，抑制IL－6活性，減少TNF等炎性因子的分泌［16］；豆甾醇能明顯減少由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激增多的環(huán)氧化酶－2和誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA的表達，從而達到抑制炎癥的作用［17］。分子對接結果表明，這兩種植物類甾醇，均可以同CHRM2、F2R、P38及TNF－α穩(wěn)定結合，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛的作用。其中延胡索的連接度最高，并且關鍵化合物中槲皮素、豆甾醇和益母草素均來源于延胡索，證明延胡索治療癌性疼痛中的炎性來源疼痛確有療效。

對少腹逐瘀湯治療癌性疼痛的KEGG富集研究發(fā)現(xiàn)，少腹逐瘀湯能夠影響促興奮性氨基酸的合成，并通過神經(jīng)活性配體－受體相互作用影響疼痛信號的傳導，表明少腹逐瘀湯有效成分可能通過影響神經(jīng)遞質的傳遞，從而達到治療癌性疼痛的目的。在治療腫瘤方面，一共富集出腫瘤有關通路15條（9.87%），并主要富集在結直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮內膜癌等腹盆腔腫瘤中。這提示應用少腹逐瘀湯在治療腹盆腔腫瘤所致的癌性疼痛過程中，也會對原發(fā)腫瘤產(chǎn)生治療效果。

分子對接結果顯示，CHRM2、F2R、P38及TNF－α與受體對接效果更加緊密，意味著在治療癌性疼痛方面可能發(fā)揮更為重要的作用。CHRM2是毒蕈堿樣膽堿能受體（muscarinic cholinergic receptor mAChRs）的M2亞型，通過G蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶促使環(huán)磷酸腺苷減少，從而在神經(jīng)調節(jié)鎮(zhèn)痛方面起到重要作用。誘導CHRM2在神經(jīng)病理性疼痛中正常表達，可以有效增強毒蕈堿對神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用［18］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，小茴香、干姜、當歸、沒藥、蒲黃、赤芍、延胡索可以靶向該蛋白，意味著少腹逐瘀湯通過這些藥物可以對癌性疼痛中的神經(jīng)源性疼痛產(chǎn)生治療作用。

F2R是PAR－1的別稱，是凝血酶受體，屬于蛋白酶活化受體家族（protease－activated receptors，PARs），能夠被凝血酶激活，并通過傳入神經(jīng)元，降低疼痛閾值。研究發(fā)現(xiàn)，鞘內注射凝血酶，可以引起長期的痛覺過敏［19－20］。并且PAR－1在體外通過多種機制參與癌細胞的侵襲和傳播，降低上皮細胞鈣黏蛋白，并增加α－平滑肌肌動蛋白的表達，兩者都是上皮間質轉化的標志［21］。最近發(fā)現(xiàn)PAR－1在肺癌、大腸癌、前列腺癌和卵巢癌等多種腫瘤細胞株中均有高表達。網(wǎng)絡藥理學研究發(fā)現(xiàn)，少腹逐瘀湯中小茴香、川芎、延胡索、沒藥、蒲黃均可靶向F2R，說明少腹逐瘀湯不僅能起到止痛的作用，對原發(fā)腫瘤也有一定程度的治療作用。

P38 MAPK信號通路是絲裂酶原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）家族中重要組成部分。MAPK是細胞內重要的信號轉導系統(tǒng)之一，多種炎癥因子及應激反應可使p38 MAPK的酪氨酸和蘇氨酸雙磷酸化，從而激活p38 MAPK，參與疼痛的發(fā)生和維持［22］。分子對接結果表明，少腹逐瘀湯中的有效化學成分，可以與其緊密結合，參與p38 MAPK的調節(jié)。

TNF－α是一種致炎細胞因子，作為一種參與疼痛發(fā)生、發(fā)展的調節(jié)因子，在神經(jīng)軸突內逆行或順行運輸。正常情況下，TNF在神經(jīng)組織中表達水平較低，在神經(jīng)組織自身缺血、受損、炎性病變時，TNF－α的含量迅速升高，能通過多種途徑誘導致痛物質前列腺素E2、緩激肽的產(chǎn)生，在疼痛形成與維持的過程中扮演重要角色。延胡索、沒藥、蒲黃、赤芍均可靶向TNF－α，調節(jié)炎癥的發(fā)生發(fā)展，并緩解由炎癥所致疼痛。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術，對少腹逐瘀湯治療癌性疼痛的機制進行探索。少腹逐瘀湯對癌性疼痛的治療是基于多組分、多靶點、多通道的綜合藥理作用，為晚期腫瘤患者疼痛治療提供參考，也為下一步的研究提供理論基礎。