張林，歐祥琴，王喜紅，唐閣

1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550001；3.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193

腹膜透析是終末期腎臟病主要替代療法之一，全世界已經(jīng)有超過27.2萬的患者接受腹膜透析（peritoneal Dialysis，PD），約占全球透析總?cè)丝诘?1%。我國接受PD的患者將近9萬人，約占全球PD患者總?cè)藬?shù)的33%。研究表明，PD治療前期患者的營養(yǎng)狀態(tài)、生活質(zhì)量及生存率優(yōu)于血液透析［1－2］。長期PD患者由于腹膜長時間接觸具有高滲、高糖、低pH值和葡萄糖代謝產(chǎn)物的腹膜透析液，會導致腹膜形態(tài)與功能發(fā)生改變，最終引起腹膜纖維化（peritoneal fibrosis，PF）［3］。PF的進展會導致腹膜的超濾衰竭，最后迫使PD患者結(jié)束腹膜透析治療［4］。預(yù)防和延緩PF的進展是確保長期PD患者透析進行的關(guān)鍵。

中醫(yī)沒有PF的相關(guān)論述，但是根據(jù)其特點可將其歸屬于“腹絡(luò)微癥積”的范疇。根據(jù)中醫(yī)學對癥積的論述，有學者認為痰濕和瘀血是PF進展原因，主要病機為脾腎虧虛，痰瘀互結(jié)［5］。扶腎顆粒能延緩腹膜纖維化的進展，改善腹膜的超濾功能［6－7］。方中黃芪為君，入脾，補脾益氣且利水以消腫；淫羊藿為臣，歸肝腎，能壯陽溫腎，扶腎補氣；佐當歸，其氣輕辛，補血行血，行中有補；半夏、陳皮疏導氣機，預(yù)防君藥壅滯氣機；丹參、熟大黃、鬼箭羽三者共為佐使藥，以祛濕瀉濁血之邪。扶腎顆粒延緩PF的相關(guān)機制仍不清楚。本研究基于GEO基因芯片技術(shù)和分子對接探索扶腎顆粒延緩PF的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 資料尋找扶腎顆粒靶點：TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）篩選扶腎顆粒成分靶點，UniProt數(shù)據(jù)庫（https：／／www.uniprot.org／）篩選靶點蛋白對應(yīng)的基因。尋找PF靶點：OMIM數(shù)據(jù)庫（https：／／www.omim.org／）和gene card數(shù)據(jù)庫（https：／／genecards.weizmann.ac.il／v3／）檢索PF相關(guān)的基因。交集靶點蛋白互作用：String數(shù)據(jù)庫（https：／／string－db.org／cgi／input.pl）和Cytoscape 3.7.1軟件做蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖。富集分析：基于R Stuidio1.2.5042版本的R 4.0.0語言做GO和KEGG富集分析。GEO數(shù)據(jù)庫驗證：GEO數(shù)據(jù)庫（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）檢索PF相關(guān)的基因表達信息，并通過R4.0.0進行差異基因分析，驗證扶腎顆粒治療PF的基因信息。分子對接：PDB數(shù)據(jù)庫（https：／／www.rcsb.org／）搜索主要蛋白的結(jié)構(gòu)式；PyMOL 2.4.0切除蛋白配體和分子對接演示；AutodockTools 1.5.6做網(wǎng)格盒子；Autodock Vina做分子對接。

1.2 方法

1.2.1 藥效成分篩選根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索扶腎顆粒的化學成分。根據(jù)口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為標準進行篩選，建立符合標準的成分數(shù)據(jù)列表。并將獲取的靶蛋白數(shù)據(jù)根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫的對應(yīng)基因，校正標準化靶點的基因名稱。

1.2.2 疾病相關(guān)靶點檢索根據(jù)genecard及OMIM數(shù)據(jù)庫直接檢索關(guān)鍵詞“Peritoneal Fibrosis”的信息，將目前已經(jīng)證實與PF相關(guān)的疾病靶蛋白或靶基因集合，建立數(shù)據(jù)列表。

1.2.3 構(gòu)建方劑－成分－靶標－疾病網(wǎng)絡(luò)示意圖首先通過R4.0.0對兩份數(shù)據(jù)集取交集處理，即得到扶腎顆粒與PF相關(guān)的潛在藥效成分和作用靶標，導入String數(shù)據(jù)庫，通過Cytoscape 3.2.1軟件可視化多元素多水平間的作用關(guān)系，并計算相互作用維度。

1.2.4 通路的富集分析通過R4.0.0中的clusterProfile、pathview、org.Hs.eg.db等相關(guān)生物包，進行扶腎顆粒與PF相關(guān)靶基因的GO和KEGG富集分析。

1.2.5 GEO數(shù)據(jù)庫基因芯片探究PF的相關(guān)基因表達在GEO數(shù)據(jù)庫中，找到GSE62928的基因芯片，以探針GPL13158對基因進行注釋，根據(jù)R4.0.0中的limma和impute程輯包，以logFoldChange＝1和校正后的P＜0.05進行基因篩選，將數(shù)據(jù)進行分組，找到相關(guān)基因的表達差異，與1.2.3項下方法找到的疾?。幬锘蚪患M行比較，檢測相關(guān)基因的表達。

1.2.6 分子對接根據(jù)1.2.3項下方法找出互作用中度最高的前5個蛋白，在PDB數(shù)據(jù)庫搜索主要蛋白的結(jié)構(gòu)式并下載；PyMOL 2.4.0切除蛋白配體和分子對接演示；AutodockTools 1.5.6做網(wǎng)格盒子；Autodock Vina做分子對接。

2 結(jié)果

2.1 藥效成分統(tǒng)計結(jié)果通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索扶腎顆粒，共篩選出109個有效成分，其中黃芪20個，當歸2個，淫羊藿23個，陳皮5個，半夏13個，丹參65個，大黃16個，鬼箭羽8個。其中有10個成分是共有成分，見表1。

表1 扶腎顆粒藥物共有成分

2.2 疾病靶標成分篩選根據(jù)2.1項下所搜索的藥物成分，使用UniProt數(shù)據(jù)庫，查詢相關(guān)靶點基因的信息，共獲得藥物靶基因270個，并導入Cytoscape 3.7.1，根據(jù)度（degree）值大小篩選前5個成分，見表2。

表2 度值排名前5位的藥物成分

2.3 PF靶標成分篩選和PPI網(wǎng)絡(luò)以“Peritoneal Fibrosis”作為關(guān)鍵詞，使用OMIM，genecard數(shù)據(jù)庫，搜索到與PF相關(guān)的靶標基因共408個，與2.2項下所得的藥物靶標取交集，共有84個相交基因。

所獲取的藥物與疾病靶標交集導入String網(wǎng)，物種選擇Homo sapiens，將隨機交互的可信度設(shè)置成0.4，最低評分0.4時為中等可信度，0.7表示高可信度，0.9表示最高可信度。本研究選用了中等可信度的PPI網(wǎng)絡(luò)，將對應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖下載成TSV格式，用R4.0.0的靶標做條形圖，如圖1。

圖1 分子互作用條形圖

條形體顯示了蛋白互作的度，可知排名前5位的蛋白是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、RAC－α絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（RAC－alpha serine／threonine protein kinase，AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、促分裂原活化蛋白激酶3（promote the split the original activated protein kinase 3，MAPK3）。

2.4 GO功能和KEGG富集分析

2.4.1 GO功能富集分析利用R4.0.0中的org.Hs.eg.db和clusterProfiler程輯包對扶腎顆粒治療PF的預(yù)測靶點進行GO功能富集分析，先根據(jù)org.Hs.eg.db進行ID轉(zhuǎn)換，進行GO富集分析選取的相關(guān)靶點（P＜0.05），共有118個靶點。提取核心交互靶點前20個，見圖2。蛋白的作用機制主要和細胞因子活性（cytokine activity）、細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、受體配體結(jié)合（receptor ligand activity）有關(guān)。

圖2 GO富集分析條形圖

2.4.2 KEGG富集分析利用R4.0.0中的org.Hs.eg.db和clusterProfiler程輯包對扶腎顆粒治療PF的預(yù)測靶點進行KEGG通路富集分析，設(shè)定pvalue Cutoff＝0.05，qvalue Cutoff＝0.05，共得到163條通路，提取核心通路20個，見圖3。主要通路有糖基化終產(chǎn)物受體配體通路（AGE－RAGE）、液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路（fluid shear stress and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、癌癥蛋白聚糖信號通路（Proteoglycans in cancer）等相關(guān)通路?；蛟贏GE－RAGE通路富集情況，見圖4。

圖3 KEGG通路富集分析圖

圖4 基因在AGE－RAGE通路的富集情況示意圖

2.5 GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析通過GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE62928的基因芯片，先根據(jù)探針GPL13158對GSE62928數(shù)據(jù)集進行基因差異表達分析，GSE62928共包括8個數(shù)據(jù)系列，其中GSM1536406、GSM1536407、GSM1536408、GSM1536409是PF的數(shù)據(jù)序列，GSM1536410、GSM1536411是腹膜透析首次植入腹膜透析導管的數(shù)據(jù)系列，依次分成PF組和PD組，使用R4.0.0對兩組數(shù)據(jù)進行比較，以log-FoldChange＝1和校正后的P＜0.05進行基因篩選，共得到差異表達基因725個，其中上調(diào)基因408個，下調(diào)基因317個。將得到PD組與PF組的差異基因進行火山圖繪制，見圖5。紅色部分是上調(diào)基因，綠色是下調(diào)基因。根據(jù)所得到前50位的差異基因繪制聚類熱圖，見圖6。將獲得的差異基因與2.3所得到的疾病藥物基因進行交集處理，共得到6條差異基因，分別是TIMP1、F3、HSPB1、HIF1A、CL2、IL－6，均為上調(diào)基因，說明扶腎顆粒治療PF可能與抑制這6條基因的表達有關(guān)。

圖5 PD組與EPS組差異基因表達火山圖

圖6 PD組與PF組基因表達差異的聚類熱圖

2.6 分子對接搜索PDB數(shù)據(jù)庫，根據(jù)蛋白互作圖中的前5位（TNF、IL－6、AKT1、VEGFA、MAPK3）搜索相關(guān)蛋白，檢索出TNF共599、IL－6共22個，AKT1共51個，VEGFA共41，MAPK3共3個，以配體作為篩選項，根據(jù)排名前5位的藥物成分（槲皮素、山柰酚、毛地黃黃酮、7－O－甲基異丙醇胺、丹參酮IIA）結(jié)構(gòu)圖選擇對應(yīng)的蛋白。根據(jù)化學結(jié)構(gòu)篩選，屬于TNF的具有乙內(nèi)酰脲抑制劑的蛋白3L0V和屬于MAPK3的人類有絲分裂原激活激酶相關(guān)的2ZOQ蛋白，與配體體結(jié)構(gòu)和藥物成分結(jié)構(gòu)類似，故選擇兩個大分子行半柔性對接。

經(jīng)PyMOL 2.4.0去除3L0V和MAPK3的水分子后切除配體，保存為pdb格式，使用AutodockTools 1.5.6把文件格式統(tǒng)一轉(zhuǎn)換成pdbqd格式，并根據(jù)原配體所在位置設(shè)置網(wǎng)格盒子相關(guān)參數(shù)，根據(jù)參數(shù)使用Autodock Vina做分子對接。

一般認為分子對接時，結(jié)合能越低，構(gòu)想越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大，結(jié)合能＜0說明配體和受體可以自發(fā)結(jié)合［8］。對接結(jié)果見表3，根據(jù)分子結(jié)合能值，可見毛地黃黃酮與兩個大分子蛋白的對接結(jié)合能最低，更容易自行對接，對毛地黃黃酮與2ZOQ和3L0V進行分子對接，對接結(jié)果見圖7。

表3 分子對接結(jié)果

圖7 毛地黃黃酮與2ZOQ和3L0V分子對接示意圖

3 討論

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選OB和DL值獲得扶腎顆粒的化學成分共21種，基于該活性成分預(yù)測靶點267個，搜索出PF的靶基因共408個，疾病基因與藥物基因配對且符合評分0.4的PPI網(wǎng)絡(luò)的靶點84個。

在PF的發(fā)病機制中，TGF－β1被普遍認為是PF發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子［9］，通過TGF－β／Smad通路介導PF，TGF的相關(guān)受體具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性，這與AKT1有關(guān)，此外，NF－κB、VEGF、IL－6的上調(diào)還會介導PF的發(fā)生與發(fā)展。本研究探索扶腎顆粒治療PF的相關(guān)通路，就與上述因子相關(guān)。

本研究蛋白互作用度的前5位分別是：TNF、IL－6、AKT1、VEGFA、MAPK3。研究發(fā)現(xiàn)，扶腎顆?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)TNF－α改善PD大鼠腸屏障功能障礙［10］，還可以下調(diào)PD大鼠腎腦組織中NF－κB的表達，減輕大鼠中樞神經(jīng)損傷［11］，減輕腹膜透析大鼠的腎功能損傷，保護殘余腎功能，改善PD大鼠的超濾量及葡萄糖轉(zhuǎn)運量，抑制促纖維化因子TGF－β1、CTGF、IL－6、CTGF等的表達［12］，還能明顯調(diào)節(jié)VEGF的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可以預(yù)防PF的發(fā)展［13－14］，這可能是治療長期腹膜透析PF的關(guān)鍵，而丹參酮可以誘導間充質(zhì)干細胞的分化［15］。在人體臨床實驗中，扶腎顆粒能減輕腹膜透析患者胃腸功能障礙［16］，延緩腹膜的超濾功能衰竭［17］。

在77個GO富集分析中，多為細胞凋亡和增殖、炎性反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等。在24個KEGG通路中，主要通路有糖基化終產(chǎn)物受體配體通路（AGERAGE）、液體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、癌癥蛋白聚糖信號通路（Proteoglycans in cancer）等相關(guān)通路。研究發(fā)現(xiàn)，在長時間的PD患者體內(nèi)會在腹膜中沉淀糖降解產(chǎn)物（GDPs）和糖基化終產(chǎn)物（AGEs）。GDPs可以促進AEGs的產(chǎn)生，導致炎癥細胞聚集、炎癥因子活化，并通過各種細胞內(nèi)信號途徑的活化引起血管內(nèi)皮生長因子過度表達［18］。研究發(fā)現(xiàn)，扶腎顆?？梢酝ㄟ^AGE－RAGE信號通路抑制PF［19］，還可以通過抑制TNF－α改善PD大鼠腸屏障功能障礙［10］，這與本研究得出的結(jié)論一致。

根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫的GSE62928基因芯片分析，在扶腎顆粒和PF的交集基因中，最終得到6個差異表達基因（P＜0.05），6個基因均為上調(diào)基因，分別是TIMP1、F3、HSPB1、HIF1A、CL2、IL－6。IL－6為蛋白互作靶點的第2位，IL－6在PF的進展和預(yù)后具有重要地位。有學者建議將IL－6等生化標志物用作PF早期診斷及預(yù)后評估［20－21］。分子對接結(jié)果顯示2ZOQ與3L0V與毛地黃黃酮對接結(jié)果良好，這兩個分子可能是扶腎顆粒治療PF的靶點。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法、GEO基因芯片技術(shù)和分子對接技術(shù)，探討扶腎顆粒治療PF的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機制是可行的，但是本研究也具有一定的局限性，所得結(jié)論均基于數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)絡(luò)藥理學統(tǒng)計技術(shù)，缺乏相關(guān)實驗數(shù)據(jù)的驗證和支持。本研究旨在為后續(xù)深入研究提供思路和參考。