楊俊偉,楊帥平,王長安,吳秋杰
鄭州市第七人民醫(yī)院,河南 鄭州 450000
腎移植是挽救終末期腎病患者生命的最佳方式。隨著器官保存技術(shù)、配型技術(shù)的進步、新型免疫抑制劑的應(yīng)用,腎移植效果得以顯著改善,但腎移植患者長期存活率并未顯著提高[1-2]。研究證實,慢性排斥反應(yīng)是導(dǎo)致腎移植失敗的主要原因,也是降低腎移植患者長期存活率的關(guān)鍵[3-4]。故探尋抑制腎移植后慢性排斥反應(yīng)的有效方式,對改善腎移植患者遠期預(yù)后至關(guān)重要。雷公藤多苷是從中藥衛(wèi)矛科雷公藤屬植物提取的、臨床上廣泛應(yīng)用的非甾體類免疫抑制劑或抗炎藥物[5-6]。近年來有學(xué)者將雷公藤多苷應(yīng)用于腎移植術(shù)后,可顯著降低急性排斥及慢性腎移植腎病發(fā)生率[7]。腎移植后細胞免疫、局部免疫將發(fā)生變化,T細胞亞群是反映機體免疫狀態(tài)的重要指標,也是腎移植后關(guān)鍵性效應(yīng)細胞[8-10],目前其變化規(guī)律尚不明確。鑒于此,本研究通過建立腎移植后慢性排斥反應(yīng)大鼠模型,觀察雷公藤多苷對大鼠腎移植后慢性排斥反應(yīng)的抑制作用,并探討其對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞/Th17亞群分化的影響。
1.1 動物SPF級雄性近交系F344大鼠45只及Lewis大鼠55只作為供體與受體,12~16周齡,體質(zhì)量(275±25)g,購自北京維泰瑞技術(shù)服務(wù)發(fā)展有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2019-0013。溫度(24±1)℃、相對濕度(55±5)%、12 h/12 h明暗交替環(huán)境中。本研究經(jīng)鄭州市第七人民醫(yī)院倫理委員會審核通過,倫理批號:20191015028。
1.2 藥物與試劑雷公藤多苷片(貴州漢方藥業(yè)有限公司,批號:20180369);環(huán)磷酰胺片(吉林通化茂祥制藥有限公司,批號:20180673);戊巴比妥鈉(上海紫一試劑廠,批號:57-33-0);環(huán)孢素A(辰欣藥業(yè)股份有限公司,批號:20173117);40 ng·L-1多聚甲醛溶液(南京化學(xué)試劑股份有限公司,貨號:50-00-0);尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(serum creatinine,Scr)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,貨號:1534668026、1535528451);白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-17 ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:SEKR-0003、SEKR-0007);IL-23 ELISA試劑盒(上海極威生物科技有限公司;貨號:GV-E13936);CD4單克隆抗體、CD25單克隆抗體、IL-17單克隆抗體、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)多克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司,貨號:ab183685、ab283576、ab100556、ab215715、ab150077)。
1.3 儀器7600型全自動生化分析儀(日本株式會社日立制作所);Synergy H4型全功能酶標儀(美國Bio Tek公司);SM2010R型切片機、EG1150型分體式包埋機(德國Leica公司);Cytomics FC 500型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司);BX51型顯微鏡(日本Olympus公司)。
2.1 動物模型的建立及分組供體手術(shù):將45只F344大鼠用戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,固定其四肢、頭部、尾部于手術(shù)臺上,術(shù)區(qū)消毒、備皮,腹部作十字切口,逐層深入,將腸管等腹腔內(nèi)容物翻出,充分暴露手術(shù)視野,用濕鹽水棉簽將腹膜分開,找出、游離左側(cè)輸尿管,為避免缺血性壞死,需保留輸尿管臨近脂肪,左側(cè)腎臟、腎動靜脈、腎頸動脈被充分游離后,用9~0號線結(jié)扎腎上腺血管、性腺血管,游離整段腔靜脈、腹主動脈,并結(jié)扎屬支、遠心端腔靜脈、主動脈,在腎血管上方1 cm左右位置腔靜脈、主動脈各留一根線結(jié),留待灌洗時結(jié)扎。將硬膜外管置入腎動脈下方2 cm左右位置,用線結(jié)扎固定留待灌洗。將腎動脈上方腹主動脈線結(jié)收緊,推注2 mL冷藏H-CA離體腎保存液,可觀察到腎臟變白。將腎動脈上方腔靜脈線結(jié)收緊,剪斷下方腔靜脈,推注H-CA離體腎保存液,自腹主動脈、左腎動脈、腎臟、左腎靜脈、下腔靜脈依次流出,H-CA離體腎保存液,充分灌洗腎臟至其發(fā)白[11]。將腎靜脈上方腔靜脈及腎動脈上、下腹主動脈剪斷,于冰水混合物中修剪離體腎臟,保留腎靜脈遠端一血管瓣,以濕鹽水紗布覆蓋,冷藏備用。
受體手術(shù):受體45只Lewis大鼠術(shù)前準備同供體,游離腹主動脈、下腔靜脈,結(jié)扎主動脈分支、腔靜脈屬支,腔靜脈兩端采用血管夾夾閉以阻斷腔靜脈血流,采用10~0號線將供腎靜脈上下端、腔靜脈開口兩端縫合,連續(xù)縫合腔靜脈、腎靜脈,用動脈夾將腹主動脈阻斷,剪梭形切口,便于吻合供腎動脈。吻合完成后,將供腎動脈夾閉,開放血流,確認無活動性出血后將腎動脈與靜脈開放,可觀察到移植腎迅速充盈,顏色從蒼白轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅,移植腎動脈充盈、搏動較好,靜脈充盈,吻合口無狹窄,輸尿管見清亮尿液流出。采用輸尿管膀胱植入法移植輸尿管。確認移植腎無活動性出血及其他異常后回納腸管,縫合傷口,腹腔注射5 mL青霉素8萬U。大鼠清醒后飼喂糖鹽水,任其自主活動,尾靜脈注射環(huán)孢素A(5 mg·kg-1),連續(xù)10 d。其余10只Lewis大鼠為假手術(shù)組,開腹后隨即連續(xù)全層關(guān)閉,其他操作同上。將移植成功且術(shù)后10 d仍存活的42只大鼠(死亡3只)隨機分為模型組(10只)、雷公藤多苷低劑量組(10只)、雷公藤多苷高劑量組(11只)、環(huán)磷酰胺組(11只)。
2.2 干預(yù)方式根據(jù)人與大鼠的體表面積比例換算為等效劑量為6.3~9.5 mg·(kg·d)-1。結(jié)合前期研究確定雷公藤多苷使用劑量,術(shù)后第11天開始灌胃,雷公藤多苷低、高劑量分別為10 mg·kg-1、20 mg·kg-1,環(huán)磷酰胺的劑量為15.6 mg·kg-1,假手術(shù)組與模型組均給予等量生理鹽水灌胃,連續(xù)灌胃至移植后12周。
2.3 檢測大鼠血清BUN、Scr水平末次灌胃后4 h,腹主動脈血,3 000 r·min-1離心15 min(離心半徑12 cm),取上清。采用全自動生化分析儀,以酶偶聯(lián)速率法、BUN試劑盒檢測血清BUN水平,以堿性苦味酸法、Scr試劑盒檢測血清Scr水平。
2.4 大鼠血清IL-2、IL-23、IL-17檢測取血清,嚴格按照試劑盒說明書,采用ELISA法測定血清中IL-2、IL-23、IL-17水平。
2.5 大鼠血清CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、Th17細胞檢測取冷凍保存血清,制備成淋巴細胞懸液,調(diào)整密度至5×105mL-1,加入異硫氰酸熒光素標記的抗CD4單克隆抗體,藻紅蛋白標記的抗CD25單克隆抗體,以陰性對照管設(shè)門,流式細胞儀檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞百分比。調(diào)整淋巴細胞密度至5×106mL-1,加入異硫氰酸熒光素標記的抗CD4單克隆抗體,藻紅蛋白標記的抗IL-17單克隆抗體,破膜后以陰性對照管設(shè)門,采用多參數(shù)流式細胞術(shù)檢測Th17細胞占比。
2.6 腎組織病理學(xué)觀察及慢性排斥反應(yīng)評價取血清后處死大鼠,無菌摘取左腎去除包膜,以預(yù)冷生理鹽水洗滌,自腎門沿冠狀面縱向剖開分成兩半,一半腎組織-20℃保存,另一半置于40 ng·L-1多聚甲醛溶液中固定24 h后,乙醇脫水、二甲苯透明、浸潤石蠟制作成蠟塊,以病理切片機制作成4μm連續(xù)切片,脫蠟后HE染色,顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)變化。按照Banff 2007移植腎病理學(xué)分類標準對腎移植后的慢性排斥反應(yīng)進行評價,評價項目包括移植腎組織單個核細胞浸潤、腎小管萎縮、腎小球硬化、小動脈內(nèi)膜纖維性增厚、間質(zhì)纖維化5項,無病變、輕度病變、中度病變、嚴重病變分別0、1、2、3分,總分0~15分。每個標本隨機選取10個視野,取平均值。
2.7 移植腎組織TGF-β1表達檢測取冷凍保存的腎組織切片,常規(guī)脫蠟,PBS沖洗,3%過氧化氫孵育10 min,蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min。滴加5 mL枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液,微波高火10 min,常溫下冷卻至40℃,蒸餾水沖洗,山羊血清室溫封閉15 min,棄去血清后甩干,滴加兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體,37℃孵育2 h,滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗,37℃孵育30 min,顯微鏡下DAB染色,自來水沖洗10 min,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水,中性樹膠封片。以胞質(zhì)和(或)胞膜中觀察到棕黃色顆粒為陽性,同時對陽性細胞數(shù)面積及陽性染色強度進行評分,陽性細胞數(shù)面積<5%、5%~25%、25%~50%、50%~75%,>75%分別為0、1、2、3、4分,陽性染色強度藍色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2、3分以兩者乘積表示TGF-β1表達的強度。采用顯微鏡于400倍下隨機選取10個視野,求平均值。
2.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件分析,計量資料以均值±標準差(±s)表示,多樣本資料比較采用單因素方差分析,若Levene檢驗方差齊,采用單因素方差分析進行總均值比較,然后采用LSD-t行兩兩比較,若Levene檢驗方差不齊,改用welch檢驗進行總體均值比較,然后再采用Dunnett T3檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
3.1 各組大鼠血清BUN、Scr水平比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清BUN、Scr水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷低、高劑量組及環(huán)磷酰胺組血清BUN、Scr水平顯著降低(P<0.05)。見表1。
表1 各組大鼠血清BUN、Scr水平比較(±s)
表1 各組大鼠血清BUN、Scr水平比較(±s)
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
組別 n BUN(c/mmol·L-1)Scr(c/μmol·L-1)10 8.25±0.97 74.58±9.47模型組 10 47.74±7.89* 158.96±20.44*雷公藤多苷低劑量組10 38.89±4.50# 130.25±19.66#雷公藤多苷高劑量組11 30.82±5.77# 116.59±17.52#環(huán)磷酰胺組 11 22.35±4.66# 99.42±12.58假手術(shù)組#
3.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清IL-2水平顯著降低,IL-23、IL-17水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷低、高劑量組及環(huán)磷酰胺組大鼠血清IL-2水平顯著升高,IL-23、IL-17水平顯著降低(P<0.05)。見表2。
表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 ±s,μg·L-1)
表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 ±s,μg·L-1)
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
IL-2 IL-23 IL-17假手術(shù)組組別 n 10 5.98±0.87 2.86±0.37 4.05±0.62模型組 10 2.67±0.36* 4.79±0.63* 6.58±0.81*雷公藤多苷低劑量組 10 3.18±0.49# 4.02±0.56# 5.79±0.70#雷公藤多苷高劑量組 11 3.95±0.51# 3.78±0.42# 5.02±0.62#環(huán)磷酰胺組 11 4.91±0.74# 3.32±0.48# 4.74±0.59#
3.3 各組大鼠血清CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、Th17細胞檢測與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞占比顯著降低,Th17細胞占比、Th17細胞/CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞顯著升高(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷低劑量組、雷公藤多苷高劑量組、環(huán)磷酰胺組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞占比顯著升高,Th17細胞占比、Th17細胞/CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞顯著降低(P<0.05)。見表3,圖1、圖2。
圖2 流式細胞儀檢測Th17細胞占比
表3 各組大鼠血清CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、Th17細胞檢測 (±s)
表3 各組大鼠血清CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、Th17細胞檢測 (±s)
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
組別 n CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞/%Th17細胞/%Th17細胞/CD4+CD25調(diào)節(jié)性T淋巴細胞假手術(shù)組10 3.24±0.49 0.55±0.07 0.17±0.02模型組 10 0.68±0.07* 2.37±0.34* 3.54±0.41*雷公藤多苷低劑量組10 1.72±0.24# 1.74±0.25# 1.01±0.15#雷公藤多苷高劑量組11 2.25±0.30# 1.31±0.29# 0.58±0.07#環(huán)磷酰胺組 11 2.82±0.36# 1.08±0.17# 0.38±0.04#
圖1 流式細胞儀檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞占比
3.4 各組大鼠腎組織病理學(xué)形態(tài)變化比較假手術(shù)組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰,無炎性細胞浸潤;模型組大鼠腎臟有炎性細胞浸潤、腎小管萎縮變性、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)細胞水腫、皮質(zhì)出血等慢性排斥反應(yīng)病理表現(xiàn);雷公藤多苷低劑量組、雷公藤多苷高劑量組、環(huán)磷酰胺組大鼠腎臟病理損傷較模型組有所改善,其中環(huán)磷酰胺組改善最為明顯,其次為雷公藤多苷高劑量組,最后為雷公藤多苷低劑量組。見圖3。
圖3 各組移植腎組織病理變化情況(HE染色,×400,標尺100μm)
3.5 各組腎組織排斥反應(yīng)評分比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腎臟Banff評分顯著升高(P<0.01);與模型組比較,雷公藤多苷低劑量組、雷公藤多苷高劑量組、環(huán)磷酰胺組大鼠腎臟Banff評分顯著降低(P<0.05)。見表4。
表4 各組腎組織排斥反應(yīng)評分比較 (±s,分)
表4 各組腎組織排斥反應(yīng)評分比較 (±s,分)
注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05
評分假手術(shù)組組別 n Banff 10 0.23±0.04模型組 10 8.96±1.05**雷公藤多苷低劑量組 10 6.44±0.98#雷公藤多苷高劑量組 11 4.95±0.73#環(huán)磷酰胺組 11 2.31±0.37#
3.6 各組大鼠腎組織TGF-β1表達情況比較與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腎臟TGF-β1光密度顯著升高(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷低劑量組、雷公藤多苷高劑量組、環(huán)磷酰胺組大鼠腎臟TGF-β1光密度顯著降低(P<0.05)。見表5、圖4。
圖4 各組腎組織TGF-β1表達情況(×400,標尺100μm)
表5 各組腎組織TGF-β1表達情況比較 (±s)
表5 各組腎組織TGF-β1表達情況比較 (±s)
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
光密度假手術(shù)組組別 n TGF-β1 10 0.73±0.10模型組 10 6.54±0.81*雷公藤多苷低劑量組 10 4.87±0.62#雷公藤多苷高劑量組 11 3.39±0.49#環(huán)磷酰胺組 11 2.09±0.37#
慢性排斥是移植器官長期存活的主要障礙,高血壓、高脂血癥、急性排斥反應(yīng)、長期應(yīng)用環(huán)孢霉素A、供腎缺氧缺血等是其發(fā)生的危險因素[12-14]。目前臨床并未完全闡明其發(fā)病機制,認為與急性排斥反應(yīng)、免疫抑制不足等因素有關(guān)[15-16]。非特異性免疫抑制是慢性排斥反應(yīng)主要治療方式,可在一定程度上抑制排斥反應(yīng),但容易導(dǎo)致感染、腫瘤等發(fā)生[17]。研究證實,慢性排斥移植腎間質(zhì)中存在較多活化T淋巴細胞,且腎動脈病變內(nèi)膜皮下、腎小管上皮細胞之間可見部分T淋巴細胞[18]。因此,T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫可能參與慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。探尋有效促進T淋巴細胞亞群分化,抑制慢性排斥反應(yīng)對延長移植腎存活時間具有重要意義。
腎組織TGF-β1是腎小管、腎小球上皮細胞分泌的關(guān)鍵性纖維生成細胞因子,其表達水平與腎移植后腎組織的纖維化關(guān)系密切,參與慢性排斥過程中基質(zhì)的擴張[19-20]。本研究顯示,與模型組比較,雷公藤多苷低劑量組、雷公藤多苷高劑量組、環(huán)磷酰胺組大鼠血清BUN、Scr水平顯著降低,腎臟TGF-β1表達強度降低,且慢性排斥反應(yīng)顯著減輕,Banff評分顯著降低,提示雷公藤多苷可改善腎移植大鼠腎功能,減輕移植腎病理損害與慢性排斥反應(yīng)。雷公藤多苷含有雷公藤生物堿、雷公藤二萜內(nèi)酯等成分,其可增強自然殺傷細胞的細胞毒性,調(diào)節(jié)T細胞亞群分布紊亂,發(fā)揮雙向免疫調(diào)節(jié)作用。雷公藤多苷可抑制淋巴細胞、單核細胞的增殖以及補體生成、活化,減少細胞表面黏附分子合成,減輕腎組織病變,減緩腎間質(zhì)纖維細胞增生速度,阻滯細胞外基質(zhì)積聚,保護腎臟功能;誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡,干擾其生殖周期,發(fā)揮抗炎作用[21]。研究發(fā)現(xiàn),雷公藤多苷可結(jié)合細胞核中DNA,降低核因子-κB轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)揮抗增生、抗炎及免疫抑制效應(yīng)[22]。本研究結(jié)果提示,雷公藤多苷可抑制炎癥因子及淋巴細胞的活化,發(fā)揮抗增生、抗炎及免疫抑制效應(yīng)。
CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞是具有突出免疫調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)性T淋巴細胞,可抑制CD4+及CD8+T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng),并直接或間接作用于抗原提呈細胞,影響IL-2、IL-23、IL-17等炎癥因子水平,從而抑制共刺激分子表達、促使效應(yīng)細胞凋亡[23-24]。Th17細胞可特異性生成IL-17效應(yīng)因子,其在自身免疫性疾病、機體防御反應(yīng)中具有重要作用[25-26]。正常機體中,Th17細胞與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞比值維持平衡狀態(tài),當存在炎癥反應(yīng)時,Th17細胞分化增加,兩者比值失衡,Th17細胞/CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞比值升高時,促炎作用與自身免疫占據(jù)優(yōu)勢,反之抗炎作用與免疫耐受占據(jù)優(yōu)勢[27-28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與模型組比較,雷公藤多苷低劑量組、雷公藤多苷高劑量組、環(huán)磷酰胺組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞占比顯著升高,Th17細胞占比、Th17細胞/CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞顯著降低,提示雷公藤多苷可誘導(dǎo)T淋巴細胞分化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞,抑制其分化為Th17細胞,降低Th17細胞與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞比值,維持其平衡狀態(tài)。IL-2對Th17細胞分化具有抑制作用,IL-23、IL-17則廣泛參與Th17細胞的增殖與功能維持[29-30]。本研究結(jié)果顯示,雷公藤多苷可顯著升高大鼠血清IL-2水平,降低IL-23、IL-17水平,表明雷公藤多苷可上調(diào)抗炎細胞因子水平,下調(diào)促炎細胞因子水平,從而誘導(dǎo)T淋巴細胞向CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞分化,抑制慢性排斥反應(yīng),保護移植腎功能。
綜上所述,雷公藤多苷可保護大鼠腎移植后腎功能,減輕移植腎病理變化,抑制慢性排斥反應(yīng),且呈劑量依賴性,推測其作用機制與促進CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞擴增,抑制Th17細胞增殖,改善兩者平衡,上調(diào)抗炎癥細胞因子水平,下調(diào)促炎細胞因子水平有關(guān)。