白晶,曹威,劉安廷,潘惠萍,劉美華,馬新苗,唐雋

(1.佛山市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科,廣東 佛山 528000； 2.佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院 體檢中心,廣東 佛山 528000； 3.佛山市第一人民醫(yī)院禪城醫(yī)院 耳鼻咽喉科,廣東 佛山 528000)

鼻咽癌是一種源于黏膜上皮的惡性腫瘤，遺傳、環(huán)境以及特異性病毒感染均可導(dǎo)致該病的發(fā)生，在我國華南地區(qū)較為常見。由于該病的發(fā)病部位較為隱匿，沒有典型的早期癥狀，并且病情進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者確診時(shí)已錯(cuò)過最佳手術(shù)切除治療期，主要借助于放化療來緩解患者的癥狀，但鼻咽癌細(xì)胞具有惡性增殖以及高侵襲性的特點(diǎn)，患者在術(shù)后極易復(fù)發(fā)，并且伴隨頸部淋巴結(jié)等部位轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后以及生命質(zhì)量的提高[1]。因此在臨床上急需尋找有效的特異性分子標(biāo)志物用于鼻咽癌的診斷和靶向治療。已有的研究證實(shí)[2]肝激酶b1(liver kinaseB1，LKB1)、腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、速激肽受體神經(jīng)激肽-1(neurokinin receptor 1，NK-1R)等多種基因和蛋白的表達(dá)參與調(diào)控鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展以及免疫浸潤、惡性侵襲等病理過程。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucose-regulated protein 78 kDa，GRP78)是熱休克蛋白70家族中重要的成員之一，是腫瘤細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶[3]。研究顯示[4]肺癌、胃癌、黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞的異常增殖需要依靠大量的蛋白分子得以延續(xù)，而GRP78蛋白的表達(dá)上調(diào)能夠在該過程中幫助腫瘤細(xì)胞在最短的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，啟動腫瘤細(xì)胞的血管新生[5]，使腫瘤細(xì)胞免于淋巴細(xì)胞的捕殺，實(shí)現(xiàn)腫瘤逃逸。Yao等[6]研究顯示在乳腺癌中，GRP78的高表達(dá)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的適應(yīng)力，以抵抗化療藥物5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的凋亡。Gopal等[7]研究報(bào)道腫瘤細(xì)胞表面的GRP78能增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞相關(guān)巨噬細(xì)胞的活化，促進(jìn)腫瘤的生存與增殖。但是有關(guān)GRP78在鼻咽癌中的報(bào)道較少。本研究通過對臨床鼻咽癌組織樣本以及鼻咽癌細(xì)胞的研究，構(gòu)建上調(diào)GRP78表達(dá)的CNE1細(xì)胞株，來探討GRP78在鼻咽癌中的作用機(jī)制，為臨床上鼻咽癌的治療提供新的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 在線生物信息網(wǎng)站研究

從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)提取GSE32960芯片中的數(shù)據(jù)，該芯片中包含312例鼻咽癌標(biāo)本，18例正常鼻咽組織，采用BRB-Array Tools軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析GRP78的mRNA的表達(dá)情況，利用生存分析網(wǎng)站(http:// kmplot.com/analysis/)分析GRP78的表達(dá)對鼻咽癌患者預(yù)后的影響。

1.2 組織標(biāo)本

收集2018年6月—2019年6月手術(shù)切除病灶的56例經(jīng)病理確診鼻咽癌患者的腫瘤組織作為鼻咽癌組織的研究對象，男40例，女16例；年齡25～73歲，中位年齡48歲；所有患者均經(jīng)專業(yè)醫(yī)師檢查排除其他器官的惡性腫瘤史，并且是初次確診鼻咽癌，并且尚未經(jīng)過放/化療干預(yù)[8]。另取同期選取進(jìn)行治療的50例慢性鼻咽炎組織作為對照，男38例，女12例；年齡22～70歲，中位年齡45歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組患者的性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究的目的以及研究均已告知患者或其家屬，并獲得同意書。所有組織樣本生理鹽水清洗，置于液氮中冷凍10 min，然后轉(zhuǎn)至深冷冰箱中備用待測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員審批，審批號：2020-07-35AW。

1.3 細(xì)胞及主要試劑和儀器

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection，ATCC)，過表達(dá)LvGFP-Puro-GRP78以及LvGFP-Puro-GRP78-NC陰性對照由中國上海Gene Pharma生物有限公司構(gòu)建。

Trizol 試劑盒(日本TaKaRa公司)；GRP78抗體(ab21685)、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(ab125247)、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2， MMP-2)(ab92536)和MMP9(ab76003)抗體(美國abcam公司)；Brdu試劑盒、Western blot試劑盒(美國Invitrogen公司)；Transwell小室(美國的Sigma-Aldrich公司)；蘇凈Airtech超凈工作臺(美國Thermo Fisher公司)，恒溫恒壓細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)； IXplore Standard倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 免疫組化法檢測樣本組織中GRP78的表達(dá)

將各組織標(biāo)本經(jīng)5%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，修復(fù)，封閉，分別加稀釋好的一抗(1∶100)，4℃過夜孵育，次日室溫下，加入適量生物素標(biāo)記的二抗(1∶500)，適量二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復(fù)染，經(jīng)脫水，透明，干燥后，以中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野經(jīng)兩位專業(yè)醫(yī)師根據(jù)染色強(qiáng)度(0～3分，無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分)和陽性細(xì)胞比例(0～3分，<5%為0分，在5%～10%范圍內(nèi)記為1分，在11%～50%范圍內(nèi)記為2分，>50%為3分)進(jìn)行評分，總評分在0～3分記為陰性表達(dá)，在4～6分記為陽性表達(dá)。同時(shí)將GRP78的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染

將人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1復(fù)蘇后，接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于恒溫恒壓生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件37℃，5%CO2，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)85%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，CNE1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為對照組(CNE1鼻咽癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行外界干預(yù))、NC組(CNE1鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染LvGFP-Puro-GRP78-NC后，常規(guī)培養(yǎng))、Sh-GRP78組(CNE1鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染LvGFP-Puro-GRP78后，常規(guī)培養(yǎng))，轉(zhuǎn)染完成48 h后，可在熒光顯微鏡下觀察到各組細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，PCR檢測各組細(xì)胞中GRP78的mRNA的表達(dá)，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率超過90%以上時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增殖能力

調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×104個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，分組處理同上，輕輕混勻后，置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，10%甲醛固定并進(jìn)行Brdu實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒操作要求進(jìn)行。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲能力

在Transwell小室上室中加入200 μL預(yù)先稀釋的不含血清的Matrigel膠，無菌干燥箱中過夜。調(diào)整各組細(xì)胞濃度至2×105個(gè)接種在上室，下室中加入700 μL含血清的常規(guī)培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)孔，于37℃、5% CO2條件下中繼續(xù)培養(yǎng)24 h， PBS輕柔洗滌1次，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)，采用圖像處理軟件Image-Pro Plus 6.0對視野中穿過濾膜的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的血管生成能力

在96孔培養(yǎng)板上平鋪一層新鮮Matrigel溶膠，迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)無菌培養(yǎng)箱設(shè)定37℃，待Matrigel溶膠凝固后，將細(xì)胞以1×104個(gè)/mL接種在96孔板中，然后分組同上，分別加入含CNE1細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察血管生成情況并拍照記錄。

1.9 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建基質(zhì)金屬蛋白(MMP)-2-3’UTR WT以及MMP-2-3’UTR MUT質(zhì)粒，按雙熒光素酶試劑盒要求將293T細(xì)胞接種在24孔板上，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將MMP-2-3’UTR WT以及MMP-2-3’UTR MUT與miRNA以及過表達(dá)載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，Promega雙熒光素酶檢測系統(tǒng)在48 h后檢測熒光酶活性。同樣方法構(gòu)建MMP-9-3’UTR WT以及MMP-9-3’UTR MUT質(zhì)粒，按雙熒光素酶試劑盒要求將293T細(xì)胞接種在24孔板上，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將MMP-9-3’UTR WT以及MMP-9-3’UTR MUT與miRNA以及過表達(dá)載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，Promega雙熒光素酶檢測系統(tǒng)在48 h后檢測熒光酶活性。

1.10 Western blot檢測各組細(xì)胞中GRP78、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平

胰酶消化細(xì)胞，離心稀釋成細(xì)胞懸液，分組處理同上，按1×105個(gè)/孔接種至6孔板中；置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱24 h，加入蛋白裂解液，常規(guī)提取總蛋白，測定濃度，置于沸水中變性，進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)模，清洗后，在封閉液中孵育30 min，加入一抗(1∶500)，孵育過夜，加入二抗(1∶1 000)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，以GAPDH作為內(nèi)參，Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析各條帶的灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0軟件，作圖工具采用Graphpad 5.01，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GRP78基因在鼻咽癌組織中的表達(dá)

在線生物信息分析顯示，與慢性鼻咽炎組織相比，鼻咽癌組織中GRP78基因的mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；生存分析結(jié)果顯示，與GRP78低表達(dá)的患者相比，GRP78高表達(dá)的患者的生存期較低(P<0.05)；說明GRP78基因的表達(dá)與鼻咽癌患者的預(yù)后關(guān)系密切，GRP78基因的表達(dá)對于鼻咽癌具有潛在的研究價(jià)值，見圖1。

圖1 在線分析GRP78基因的表達(dá) a：GRP78基因的mRNA相對表達(dá); b:GRP78基因的表達(dá)與鼻咽癌患者生存期的關(guān)系

2.2 免疫組化檢測GRP78蛋白的表達(dá)

免疫組化檢測GRP78蛋白在各組組織中的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，GRP78在鼻黏膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，與慢性鼻咽炎組織中相比，GRP78在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯升高(t=67.985，P<0.05)，見圖2。

圖2 兩種組織中GRP78蛋白的表達(dá)情況 a:免疫組化檢測 (免疫組化 ×400)； b：柱狀圖對比

2.3 GRP78蛋白的表達(dá)與鼻咽癌患者的臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析顯示，GRP78蛋白的表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和T分期相關(guān)，與患者的年齡、性別和臨床分期無關(guān)(P>0.05)，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 GRP78蛋白的表達(dá)與鼻咽癌患者的臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系 (例，%)

2.4 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染操作后的細(xì)胞

轉(zhuǎn)染完成48 h后，與對照組相比，NC組和Sh-GRP78組細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察到的綠色熒光細(xì)胞強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而PCR結(jié)果顯示，與對照組和NC組相比，Sh-GRP78組細(xì)胞中GRP78的mRNA的表達(dá)明顯升高(F=18.951，P<0.05)，NC組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 觀察轉(zhuǎn)染操作后細(xì)胞情況 a:熒光顯微鏡觀察 (綠色熒光 ×400)； b：柱狀圖對比

2.5 Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn)對各組細(xì)胞的增殖能力

Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組和NC組相比，過表達(dá)GRP78后，Sh-GRP78組CNE1細(xì)胞的Brdu陽性比例明顯升高(F=87.364，P<0.05)，NC組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，見圖4。

圖4 觀察各組細(xì)胞的增殖能力 a:Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (Brdu ×400); b：柱狀圖對比

2.6 Transwell小室檢測各組細(xì)胞的侵襲能力

Transwell小室結(jié)果顯示，與對照組和NC組相比，過表達(dá)GRP78后，Sh-GRP78組CNE1細(xì)胞侵襲的數(shù)量明顯增多(F=108.316，P<0.05)，NC組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 觀察各組細(xì)胞的侵襲能力 a:Transwell小室結(jié)果 (結(jié)晶紫 ×400)； b：柱狀圖對比

2.7 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的血管生成能力

小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組和NC組相比，過表達(dá)GRP78后，Sh-GRP78組細(xì)胞生成管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯升高(F=96.851，P<0.05)，NC組和對照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

圖6 顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的血管生成能力 a:小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (×400); b：柱狀圖對比

2.8 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)GRP78后，野生型MMP-2和MMP-9的熒光素酶活性被激活(t=17.587，15.693，P<0.05)，突變型MMP-2和MMP-9熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，說明GRP78、MMP-2和MMP-9具有靶向調(diào)控關(guān)系，見圖7。

圖7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果 7a：MMP-2； 7b：MMP-9 圖8 Western blot檢測各組細(xì)胞中GRP78、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平 圖9 各組細(xì)胞中GRP78(9a)、MMP-2(9b)和MMP-9(9c)表達(dá)水平柱狀圖

2.9 Western blot檢測各組細(xì)胞中GRP78、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平

采用Western blot檢測各組細(xì)胞中GRP78、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與慢性鼻咽炎組織和NC組相比，Sh-GRP78組CNE1細(xì)胞中GRP78、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯上升(F=96.851，87.597，90.005，P<0.05)，NC組和對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖8、9。

3 討論

鼻咽癌是嚴(yán)重危害我國居民身體健康的惡性腫瘤之一。盡管眾多研究學(xué)者在鼻咽癌的病理發(fā)展，病情進(jìn)展的研究中取得的較為明顯的進(jìn)步，但是關(guān)于該病的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，鼻咽癌患者的整體預(yù)后較差，5年的生存率尚不盡如人意，并且該病極易復(fù)發(fā)以及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使得鼻咽癌患者難以擺脫疾病困擾[9-10]。因此尋找鼻咽癌的特異性生物標(biāo)志物，深入揭示疾病的分子發(fā)展機(jī)制，篩選出新的高效的藥物作用靶點(diǎn)，在鼻咽癌的臨床治療中具有重大意義。

研究顯示[11-12]鼻咽癌的起病以及病情進(jìn)展是一個(gè)多種基因和蛋白共同參與調(diào)控的多階段的復(fù)雜的病理生理過程。腫瘤細(xì)胞完成快速增殖的過程離不開細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成過程。蛋白質(zhì)合成后經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的的折疊、裝配才能發(fā)揮其生物學(xué)功能，而GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重要的分子伴侶，參與調(diào)控并協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成這一細(xì)胞生理過程[13-14]。Ahmadi等[15]研究證實(shí)GRP78能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長因子的釋放，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖信號的傳導(dǎo)。Qiu等[16]研究表明宮頸癌細(xì)胞通過增強(qiáng)GRP78的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血管新生。Yang等[17]研究證實(shí)腫瘤組織中GRP78高表達(dá)的三陰性乳腺癌患者的預(yù)后不佳。徐婷等[18]研究顯示在人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞中，抑制GRP78的表達(dá)能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究對臨床鼻咽癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化，結(jié)果顯示與正常鼻黏膜組織相比，鼻咽癌患者的鼻黏膜內(nèi)GRP78的表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明GRP78在鼻咽癌中具有深入研究的價(jià)值。構(gòu)建LvGFP-Puro-GRP78轉(zhuǎn)染CNE1后，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組CNE1細(xì)胞的增殖、侵襲以及血管新生的能力明顯增強(qiáng)。

腫瘤微環(huán)境中的血管新生是癌細(xì)胞增殖與侵襲的共同基礎(chǔ)；而細(xì)胞外基質(zhì)降解是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行惡性增殖與侵襲、靶器官轉(zhuǎn)移開始的主要途徑[19]。鼻咽癌細(xì)胞的這一生理過程是在眾多細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞移動分子以及大量的調(diào)控酶的相互協(xié)調(diào)下共同完成的。其中MMPs因其幾乎可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的非多糖成分，成為參與細(xì)胞侵襲過程中重要的效應(yīng)分子。Dong等[20]研究表明MMP-2和MMP-9的活性直接影響胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力。Zhang等[21]研究顯示抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)后能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的血管形成能力。Song等[22]研究表明MMP-2和MMP-9的表達(dá)與肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、上皮性卵巢癌等多種腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切。本研究雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)GRP78的靶基因?yàn)镸MP-2和MMP-9。Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組CNE1細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)隨GRP78的表達(dá)水平升高而明顯上升(P<0.05)。

綜合上述，GRP78在鼻咽癌中存在高表達(dá)的現(xiàn)象，并且GRP78靶向調(diào)控MMP-2和MMP-9的表達(dá)增強(qiáng)CNE1細(xì)胞的增殖、侵襲與血管新生的能力。但是如何將GRP78的靶向作用應(yīng)用到臨床上對鼻咽癌的治療和診斷中，還待更深入、系統(tǒng)的探索。