譚媛，王晶，賈群英，劉蓉，唐發(fā)清

(湖南省腫瘤醫(yī)院 腫瘤靶向基因湖南省重點實驗室 臨床檢驗中心，湖南 長沙 410013)

鼻咽癌是我國南方及東南亞地區(qū)一種常見的頭頸惡性腫瘤，其起源于鼻咽部上皮細胞。我國華南地區(qū)廣東、廣西和湖南發(fā)病率極高[1]。研究表明，鼻咽癌的發(fā)病不僅與EBV病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染、化學(xué)致癌物和環(huán)境暴露有關(guān)，而且與基因的遺傳性突變密切相關(guān)[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，鼻咽癌發(fā)病具有顯著的種族差異、遺傳易感性及家族聚集性[2]。遠處轉(zhuǎn)移和高度侵襲是鼻咽癌較為顯著的臨床特征，也是導(dǎo)致患者治療療效不佳、生存率降低的重要因素[3]。

組織蛋白酶(Capthesins)是一類溶酶體半胱氨酸組織蛋白酶，包括11個家族成員(Cathepsin B、C、F等)，這些溶酶體組織蛋白酶可消化清除胞內(nèi)異物，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要功能[4]。Capthesin B是Capthesins家族的重要成員，在溶酶體級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Capthesin B以主轉(zhuǎn)錄本、缺少外顯子2主轉(zhuǎn)錄本及缺少外顯子2和3主轉(zhuǎn)錄本等3個形式存在[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Capthesin B位于癌基因突變的腫瘤細胞表面，例如MCF10AneoT乳腺癌上皮細胞[6]、B16黑素瘤細胞[7]、HCT 116結(jié)腸癌細胞[8]。Capthesin B與腫瘤細胞表面膜聯(lián)蛋白II異四聚體的輕鏈結(jié)合，定位于腫瘤細胞膜的微泡中[9]，腫瘤細胞可通過膜泡、微泡或脫落外泌體分泌活性Capthesin B[10]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)Capthesin B在多種癌癥中過表達，如乳腺癌[11]、結(jié)直腸癌[8]、前列腺癌[12]、口腔癌[13]、腦癌[14]、肝癌[15]、鼻咽癌[16]和肺癌[17]。Capthesin B通過調(diào)節(jié)細胞分化、腫瘤細胞生長、自噬、凋亡、遷移、侵襲、血管生成、細胞外基質(zhì)(ECM)重構(gòu)及腫瘤免疫反應(yīng)，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[18]。Capthesin B過表達與鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。為探討Capthesin B是否可以作為鼻咽癌治療預(yù)后的評估指標(biāo)，本研究檢測了鼻咽癌患者和健康體檢者血清標(biāo)本的Capthesin B濃度，同時還檢測了鼻咽癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本Capthesin B表達，結(jié)合臨床資料分析Capthesin B與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展、治療預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

Capthesin B抗體(12216-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Capthesin B 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(CSTB，CSB-E13450h)購自武漢華美生物工程有限公司，免疫組織化學(xué)染色(IHC)試劑盒SP Rabbit & Mouse HRP Kit(CW2069)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 鼻咽癌患者血清及組織標(biāo)本

收集長沙金域醫(yī)學(xué)檢驗中心2019年8月—2020年2月50例鼻咽癌原發(fā)及癌旁正常組織標(biāo)本，所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診為鼻咽癌，其中男33例，女17例；年齡29～76歲，中位年齡為43.5歲；低分化鱗癌27例，中分化鱗癌19例，高分化鱗癌4例；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例。收集湖南省腫瘤醫(yī)院檢驗科2019年7月—2020年3月106例病理學(xué)確診為鼻咽癌患者治療前、治療后的血清標(biāo)本及臨床資料，包括年齡、性別、EBVCA-IgG、EBVEA-IgA和TNM分期等。106例鼻咽癌患者中男83例，女23例；年齡27～78歲，平均年齡(50.8 ± 12.1)歲；平均治療時間1.00(0.70, 3.00)個月；低分化鱗癌96例，中分化鱗癌8例，高分化鱗癌2例；頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。同期收集40例健康體檢者的血清標(biāo)本及臨床資料，其中男22例，女18例；年齡25～68歲，中位年齡為42歲。本研究經(jīng)湖南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會評審?fù)ㄟ^。

1.3 Capthesin B IHC分析

根據(jù)試劑盒的操作說明書進行Capthesin B IHC分析。鼻咽癌組織切片脫蠟至水；抗原熱修復(fù)；內(nèi)源性酶滅活；加一抗(Ab-cathepsin B)孵育；加二抗孵育；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；PBS返藍；中性樹膠封片、顯微鏡觀察。細胞核/細胞質(zhì)染色呈黃色或棕黃色(顏色深時為棕色)，認為靶蛋白呈陽性，陽性程度用光密度平均值表示[光密度平均值=累積光密度(IOD)/視野面積(Area)]。

1.4 鼻咽癌組織蘇木精伊紅染色(HE)

按常規(guī)組織染色進行鼻咽癌組織HE染色。即組織切片脫蠟至水，蘇木素染液染色，PBS返藍，伊紅染復(fù)染，乙醇(95%～100%)脫水，二甲苯浸泡，2次，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.5 ELISA

ELISA方法檢測鼻咽癌血清Capthesin B，具體操作按ELISA試劑盒操作說明進行。將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本，37℃溫育30 min，洗板后每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記物工作液100 μL，37℃溫育30 min；洗板后加底物溶液90 μL，37℃避光顯色20 min；加終止液終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在450 m波長依序測量各孔的光密度(OD值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值計算標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本濃度，顏色深度與樣品濃度成正比。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人鼻咽癌組織中Capthesin B表達

IHC結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中Capthesin B陽性率明顯高于癌旁正常組織(P<0.001)。TNM分期為III、IV期、中低分化、有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中Capthesin B陽性率明顯高于TNM分期為I、II期、高分化、無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，不同性別、年齡鼻咽癌組織中Capthesin B陽性率比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖1、表1。

圖1 鼻咽癌組織Capthesin B表達檢測 1a：IHC檢測鼻咽癌組織及癌旁正常組織Capthesin B表達 (IHC ×400)； 1b：鼻咽癌組織及癌旁正常組織Capthesin B表達定量分析(***P<0.001) 圖2 ELISA實驗檢測鼻咽癌患者治療前后及健康體檢組的血清Capthesin B濃度柱狀圖(*P<0.05；***P< 0.001；nsP>0.05)

表1 鼻咽癌患者組織Capthesin B 陽性率與臨床特征的相關(guān)性分析 [Q2(Q1,Q3)]

2.2 鼻咽癌患者血清Capthesin B檢測

ELISA檢測106例鼻咽癌患者治療前后及健康體檢者血清Capthesin B濃度。結(jié)果顯示，鼻咽癌患者治療前血清Capthesin B濃度明顯高于健康體檢組(P<0.05)，治療1.00(0.70, 3.00)個月后血清Capthesin B濃度顯著降低(P<0.001)，治療后鼻咽癌患者組和健康體檢組之間無顯著差異(P>0.05)，見表2、圖2。

表2 健康體檢組與鼻咽癌患者治療前后血清Capthesin B對比分析 [ng/mL，Q2(Q1,Q3)]

2.3 鼻咽癌患者血清中 Capthesin B與鼻咽癌患者臨床特征的關(guān)系

表3總結(jié)了鼻咽癌患者的臨床病理特征，包括年齡、性別、EBVCA-IgG、EBVEA-IgA和TNM分期[20]，結(jié)果表明血清Capthesin B濃度與年齡、性別無顯著相關(guān)性(P>0.05)。TNM分期III、IV期及有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中低分化鼻咽癌患者血清Capthesin B濃度顯著高于I、II期、無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化者(P<0.05)。EBVCA-IgG、EBVEA-IgA陽性患者的血清Capthesin B濃度顯著低于陰性者(P<0.05)。

表3 鼻咽癌患者血清Capthesin B 濃度與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 [ng/mL，Q2(Q1,Q3)]

2.4 血清預(yù)測

基于鼻咽癌患者治療前后血清Capthesin B水平，ROC曲線下面積(AUC)為0.670(P<0.001)，血清Capthesin B濃度臨界值為0.437 ng/mL，敏感性為90.6%，特異性為32.1%，提示血清Capthesin B可作為鼻咽癌患者治療預(yù)后的參考指標(biāo)，見圖3。

圖3 ROC曲線分析

3 討論

盡管鼻咽癌治療效果有了極大的改善，5年生存率甚至10年生存率有了顯著提高，但臨床上大部分鼻咽癌初診患者發(fā)現(xiàn)時已處晚期，伴多處轉(zhuǎn)移，治療效果往往不佳。故本研究試圖尋找敏感、特異的生物標(biāo)志物進行鼻咽癌轉(zhuǎn)移預(yù)測及療效評估。

Capthesin B在多種人類癌癥中高表達，是癌細胞分泌的一個重要物質(zhì)[21-22]，血清Capthesin B濃度的變化不僅可用于預(yù)測腫瘤進展和預(yù)后，還可用于評價治療效果。Capthesin B作為一種新型血清蛋白生物標(biāo)志物，在多種惡性腫瘤中被證實其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[23-25]。同上述研究相同，本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Capthesin B水平明顯高于無轉(zhuǎn)移組，這充分提示Capthesin B與鼻咽癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Capthesin B可望成為鼻咽癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)。本研究中鼻咽癌患者原發(fā)組織中高表達的Capthesin B提示Capthesin B與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。前期研究表明Capthesin B可通過啟動細胞保護性自噬發(fā)揮抗癌作用[26-27]。本實驗結(jié)果顯示EBVCA-IgG、EBVEA-IgA陽性患者的血清Capthesin B濃度更低，EBVCA-IgG、EBVEA-IgA陰性患者的血清Capthesin B濃度更高，可能與Capthesin B啟動細胞保護性自噬，進而抑制EBV病毒活動有關(guān)[26]。研究表明，血清高濃度Capthesin B可顯著降低癌癥患者5年生存率，目前越來越多的研究表明血清標(biāo)志物濃度的變化可有效反映疾病活動性，進而評估療效[23]。本研究檢測了鼻咽癌患者治療前和治療后的血清Capthesin B濃度，結(jié)果表明，鼻咽癌患者血清Capthesin B濃度與健康體檢組相比有所升高，而治療后患者血清Capthesin B濃度顯著下降，臨床分析表明，血清Capthesin B濃度與鼻咽癌TNM分期及分化程度密切相關(guān)，提示有血清Capthesin B濃度可作為鼻咽癌治療預(yù)后的參考指標(biāo)。綜上所述，鼻咽癌患者Capthesin B高表達，有效治療后患者血清Capthesin B顯著降低，鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Capthesin B高于無轉(zhuǎn)移組，提示Capthesin B參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展，可作為鼻咽癌治療預(yù)后的參考指標(biāo)。