李嬌，劉海

(1.遂寧市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，四川 遂寧 629000； 2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充 637000)

頭頸部腫瘤是世界上發(fā)病率排名第五的高發(fā)腫瘤，且發(fā)病率在逐年增加[1]，而喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科最常見的一種惡性腫瘤，占頭頸部腫瘤的20%[2]，病理類型以鱗狀細(xì)胞癌最為多見，少部分為腺癌，其發(fā)生率男性高于女性，但每年女性患者的比例在逐年上升，在我國以東北地區(qū)發(fā)病率最高，目前認(rèn)為吸煙和飲酒對(duì)喉癌的發(fā)生均有乘積效應(yīng)，石棉、多環(huán)芳烴、紡織粉塵、胃食管反流病[3]以及病毒感染等都是喉癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素[4]。

鑒定喉癌發(fā)生過程中涉及的機(jī)制不僅可以為喉癌的治療尋找新的靶標(biāo)，也可以為診斷和預(yù)后提供參考證據(jù)。轉(zhuǎn)錄因子是在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起作用的細(xì)胞蛋白，都是通過順式作用元件發(fā)揮其抑制或誘導(dǎo)基因表達(dá)的功能，主要根據(jù)它們與靶啟動(dòng)子序列的相互作用模式分類，早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因1(early growth response，EGR1)EGR1是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的一種，其能在有絲分裂原刺激后在細(xì)胞中表現(xiàn)出Fos樣誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，與正常細(xì)胞相比，在腫瘤細(xì)胞中EGR1表達(dá)量很低甚至不表達(dá)[5]。前期實(shí)驗(yàn)已證明泛素特異性蛋白酶7(ubiquitin specific protease 7，USP7)在喉癌中的表達(dá)及臨床意義以及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA敲低USP7后對(duì)喉癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡的影響[6]。并將敲低USP7后的喉癌細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選出差異性表達(dá)基因[7]，但是目前在喉癌中尚未見USP7和EGR1相關(guān)性的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選后的與喉癌增殖、遷移相關(guān)基因EGR1的表達(dá)并進(jìn)一步探討在喉癌細(xì)胞中USP7與EGR1之間的關(guān)系，以尋找在喉癌中存在的可能的分子治療靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

HEp-2細(xì)胞購自Boster生物工程有限公司，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素-鏈霉素雙抗，胰酶均購自美國HyClone公司，病毒載體USP7 siRNA片段，病毒載體Negative siRNA片段購自上海吉瑪生物制藥有限公司，兔抗人USP7多克隆抗體，山羊抗兔IgG二抗購自美國Proteintech Group公司，兔抗人EGR1多克隆抗體購自美國CST公司，USP7上下游引物，EGR1上下游引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Trizol試劑購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，CCK8試劑盒，ECL化學(xué)發(fā)光超敏試劑盒，RIPA裂解液均購自中國碧云天生物技術(shù)公司，Transwell小室購自美國Millipore生物科技有限公司，結(jié)晶紫購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

SDS-PAGE電泳儀，轉(zhuǎn)膜儀，成像儀，酶標(biāo)儀均購自美國BIO-RAD公司，PCR儀購自瑞士Roche Diagnostics公司，倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司，-80℃冰箱購自美國Thermo公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HEp-2細(xì)胞用含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，收集成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2 105/孔細(xì)胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,當(dāng)細(xì)胞融合度約20%～30%時(shí)，加入siRNA-USP7慢病毒、陰性對(duì)照病毒、空白組不加任何東西，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后更換培養(yǎng)基。72 h后觀察熒光表達(dá)量，轉(zhuǎn)染率大于90%，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求提取RNA及蛋白質(zhì)。

1.4 Western blot檢測(cè)USP7及EGR1蛋白的表達(dá)

RIPA細(xì)胞裂解液裂解已轉(zhuǎn)染的HEp-2細(xì)胞，提取總蛋白，并用BSA檢測(cè)總蛋白濃度，取100 μg蛋白進(jìn)行變性，10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用TBST液洗膜5 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入U(xiǎn)SP7及EGR1抗體(1∶1 500)，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜5次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG二抗，室溫?fù)u床上孵育1 h，TBST洗膜5次，每次10 min。顯影曝光，用Image-Lab圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.5 Q-PCR檢測(cè)USP7及EGR1mRNA的表達(dá)

Trizol試劑裂解已轉(zhuǎn)染的HEp-2細(xì)胞，提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA質(zhì)量，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行配制預(yù)混液，LightCyclerPCR儀上設(shè)置PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，變性，退火，延伸，熔解，降溫，分析Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析，觀察USP7、EGR1的表達(dá)情況。

1.6 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(USP7阻低組)、陰性對(duì)照組、空白組，96孔板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h每孔加入CCK8試劑10 μL，避免產(chǎn)生氣泡，然后將細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱孵育1.5 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光度值，分析細(xì)胞增殖情況。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

將轉(zhuǎn)染后的HEp-2細(xì)胞饑餓12～24 h，Transwell小室放入24孔板中，將轉(zhuǎn)染后的HEp-2細(xì)胞以每孔50 104個(gè)接種到小室，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS洗2次，甲醛固定30 min,再用PBS洗2次，甲醇透明20 min,PBS洗2次0.1%結(jié)晶紫染色15 min，棉簽輕輕搽去上層未遷移細(xì)胞，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)小室下層細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察同一視野下白光和熒光細(xì)胞數(shù)目，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染率均達(dá)到90%以上,USP7敲低建模成功后才可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 同一視野下USP7實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率 (熒光 ×200) A：普通光學(xué)顯微鏡； B：熒光顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞； C：熒光顯微鏡下陰性對(duì)照組細(xì)胞

2.2 Western blot結(jié)果

采用Image J軟件測(cè)量灰度值進(jìn)行相對(duì)定量分析，USP7和EGR1蛋白的相對(duì)表達(dá)量見圖2、3。SiRNA-USP7慢病毒在喉癌HEp-2細(xì)胞中成功敲低USP7的表達(dá)后驗(yàn)證到EGR1表達(dá)上升。

圖2 Western blot檢測(cè)USP7、EGE1蛋白表達(dá) 圖3 USP7、EGE1蛋白表達(dá)水平柱狀圖 3A：各組中USP7蛋白相對(duì)表達(dá)量； 3B：各組中EGR1蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.3 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

總RNA提取后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示，空白組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組28 s、18 s、5 s RNA 3條帶集中，無拖尾現(xiàn)象等，表示總RNA提取的質(zhì)量合格，可以進(jìn)入下一步的實(shí)驗(yàn)。

圖4 總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.4 RT-PCR結(jié)果

慢病毒轉(zhuǎn)染后，提取實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白組細(xì)胞的RNA，通過RT-PCR檢測(cè)USP7、EGR1mRNA的表達(dá)水平，各組細(xì)胞USP7、EGR1 mRNA的PCR擴(kuò)增及相對(duì)表達(dá)量見圖5、6。采用2-ΔΔCT法對(duì)各組進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果顯示在敲低USP7表達(dá)后的細(xì)胞中檢測(cè)到EGR1表達(dá)量較空白組及陰性對(duì)照組均升高。

圖5 USP7與EGR1的擴(kuò)增曲線和溶解曲線

2.5 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)USP7敲低后喉癌細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染后24、48、72 h后各組喉癌細(xì)胞增殖情況見圖7，陰性對(duì)照組和空白組在24、48、72 h差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組和空白組在24、48、72 h差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低USP7后喉癌細(xì)胞遷移能力

HEp-2細(xì)胞穿過Transwell小室膜的細(xì)胞見圖8、9，先于10倍鏡下觀察視野中細(xì)胞數(shù)量，20倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算平均值即為遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)，數(shù)據(jù)顯示空白組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)分別為142±2.82、124.6±8.96、32.4±9.70。陰性對(duì)照組和空白組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組和空白組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 USP7及EGR1 mRNA表達(dá)水平 6A：為各組中USP7 mRNA相對(duì)表達(dá)量； 6B：為各組中EGR1mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖8 Transwell檢測(cè)喉癌細(xì)胞的遷移能力 (結(jié)晶紫 ×200)

圖9 喉癌細(xì)胞的遷移能力柱狀圖

3 討論

目前喉癌的診斷方式有電子纖維喉鏡檢查、頸部CT掃描以及金標(biāo)準(zhǔn)組織病理檢查共同診斷。治療目標(biāo)是治療癌癥、保留喉功能、最大限度的提高患者生活質(zhì)量[8]。但約60%確診喉癌時(shí)已是Ⅲ期或Ⅳ期[4]。此時(shí)癌細(xì)胞已發(fā)生深部侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，目前治療方案有喉切除，單純同步放化療，全喉切除+頸淋巴結(jié)清掃+放化療，TPF誘導(dǎo)化療+同步放療聯(lián)合，靶向治療+同步放化療聯(lián)合，微波熱療+放療，基因治療等治療手段[9]，但總體療效仍較差，其5年生存率約為60.7%[8]，患者生存質(zhì)量差，對(duì)患者的生理、心理以及經(jīng)濟(jì)等方面[10]均造成很大影響。由于喉部在發(fā)聲、吞咽功能以及生活質(zhì)量方面有重要作用，因此對(duì)喉癌的研究具有重要的社會(huì)意義[8]。

隨著分子生物學(xué)的逐漸成熟，越來越多的研究證實(shí)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與許多基因表達(dá)異常相關(guān)，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)取決于許多基因家族，如原癌基因、抑癌基因、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體以及立即早期轉(zhuǎn)錄因子。USP7是去泛素化蛋白酶家族一員，已在前期研究中被證明在喉癌的進(jìn)展中作為癌基因發(fā)揮作用。EGR1是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的一種，其結(jié)構(gòu)域由3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)Cys2His2，經(jīng)最簡(jiǎn)單的ββα折疊后形成，其能在有絲分裂原刺激后在成纖維母細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中表現(xiàn)出Fos樣誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，其細(xì)胞遺傳學(xué)位置位于5q31.2，與正常細(xì)胞相比，在腫瘤細(xì)胞中EGR1表達(dá)量很低甚至不表達(dá)，已有研究證明外源性EGR1在人各種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)致癌性，相反，反義RNA抑制內(nèi)源性EGR1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化。EGR1基因產(chǎn)物直接調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(TGFβ-1)基因的表達(dá)，并在細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)EGR1通過誘導(dǎo)TGFβ-1抑制人類腫瘤生長(zhǎng)[8]。大量研究已證明EGR1屬于立即早期基因(IEG)家族編碼轉(zhuǎn)錄因子，在目前已報(bào)道的研究中既可作為腫瘤抑制因子也可作為致癌因子，但其在喉腫瘤的表達(dá)尚未見報(bào)道[11]。

EGR1是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，可以作為一種腫瘤抑制基因，直接調(diào)節(jié)p53/TP53，PTEN和TGF-β1表達(dá)。在體內(nèi)和體外模型中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的核心過程。p53對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高具有誘導(dǎo)作用，研究發(fā)現(xiàn)EGR1通過直接結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活下游標(biāo)靶基因p53啟動(dòng)子，誘導(dǎo)p53表達(dá)增加從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。并且，在動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中EGR1經(jīng)電離輻射后p53水平增高導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，EGR1促凋亡的功能主要體現(xiàn)在EGR1靶基因RB1與MDM2(鼠雙微體蛋白2)結(jié)合以防止MDM2介導(dǎo)的p53降解[13]。同時(shí)亦有研究者通過對(duì)肝細(xì)胞癌基因芯片數(shù)據(jù)分析得出EGR1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與其預(yù)后相關(guān)[14]。TGF-β是一種能在多種細(xì)胞類型中控制細(xì)胞增殖、分化以及其他功能的肽類，TGF-β的活化可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而信號(hào)失調(diào)則能增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)率。TGF-β1通常對(duì)上皮來源的細(xì)胞有抑制作用，但對(duì)某些間葉細(xì)胞則有刺激或促進(jìn)作用。反過來，TGF-β1的表達(dá)受到幾種富含GC的元件的調(diào)節(jié)，這表明EGR1可能通過刺激TGF-β1的分泌發(fā)揮抑制生長(zhǎng)作用，其反過來充當(dāng)自分泌或旁分泌劑以抑制增殖。已有研究表明外源性EGR1的表達(dá)顯著降低了人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞的生長(zhǎng)和致瘤性，HT-1080細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)EGR-1導(dǎo)致TGF-β1分泌增加并且表現(xiàn)出與EGR1表達(dá)量成比例的生長(zhǎng)抑制。相反地通過在HT-1080細(xì)胞中增加抗TGF-β1抗體能完全逆轉(zhuǎn)穩(wěn)定表達(dá)的EGR1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，這些結(jié)果表明EGR-1是控制生長(zhǎng)調(diào)節(jié)分子TGF-β1的表達(dá)的一種潛在調(diào)節(jié)機(jī)制[8]。EGR1在食管癌中的高表達(dá)則可能對(duì)于維持染色質(zhì)穩(wěn)定、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡有重要作用，并且能通過激活細(xì)胞周期蛋白D1促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入G2/M期，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化達(dá)到抑制食管癌進(jìn)展的作用[15]。EGR1能促進(jìn)骨髓細(xì)胞系分化，EGR1缺失與急性髓系白血病相關(guān)[16]。

差異性顯示是一種篩選差異性表達(dá)的新型腫瘤抑制基因的方法，主要用于篩選在正常細(xì)胞中表達(dá)而在腫瘤細(xì)胞中減少或丟失的基因。Sager等[17]提出將癌癥相關(guān)基因細(xì)分為突變或缺失的基因(I類)和調(diào)節(jié)中改變的基因(II類)，從癌癥治療角度看，I類和II類之間的區(qū)別有重大意義，糾正I類基因突變或丟失的治療方法是基因置換或填補(bǔ)基因缺陷的方法，即從基因治療方面入手將新的遺傳物質(zhì)重新載入細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。相反，II類基因的治療方法是再表達(dá)，如可以通過合適的代謝物或逆轉(zhuǎn)異常調(diào)節(jié)的藥物進(jìn)行治療，而不必替換間接參與的突變基因。Huang等[18]在對(duì)乳腺癌的研究中提出EGR1具有腫瘤抑制特性，屬于II類腫瘤抑制基因的類型。并且發(fā)現(xiàn)與正常乳腺細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞中EGR1表達(dá)下降或不表達(dá)，并且表達(dá)的EGR1能降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化能力，通過外源性藥物處理后使小鼠乳腺腫瘤中的低表達(dá)的EGR1水平上升，從而得出結(jié)論EGR1表達(dá)喪失可能使腫瘤生長(zhǎng)的失調(diào)并且EGR1充當(dāng)腫瘤抑制基因。有學(xué)者[19]在對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)EGR1基礎(chǔ)表達(dá)幾乎不可檢測(cè)，其主要是通過ARF-MDM2-p53途徑發(fā)揮抑制作用，EGR1蛋白作為p53或TGF-β受體，特異性地結(jié)合人TGF-β1啟動(dòng)子的GCE位點(diǎn)，EGR1的再表達(dá)促進(jìn)TGF-β1表達(dá)增加和分泌，并且證明在U251細(xì)胞系中EGR1表達(dá)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降，是膠質(zhì)瘤進(jìn)展期間被抑制的目標(biāo)[20]。Kim等[21]發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織與正常鼻咽組織相比EGR1表達(dá)是下降的，并且揭示了EGR1在鼻咽癌PFS(無進(jìn)展生存期)和OS(總生存期)中的陽性診斷意義。電離輻射暴露與某些編碼轉(zhuǎn)錄因子的早期立即基因的激活有關(guān)，如JUN、FOS和早期生長(zhǎng)反應(yīng)家族基因。另有學(xué)者[22]發(fā)現(xiàn)EGR1是在輻射誘導(dǎo)傳導(dǎo)信號(hào)的關(guān)鍵基因，其包含有輻射誘導(dǎo)的DNA序列，介導(dǎo)的響應(yīng)電離輻射的靶基因均為凋亡基因的效應(yīng)器如：TNF-α、p53、Rb和Bax，從而通過消除誘導(dǎo)的輻射抗性而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或凋亡。該研究發(fā)現(xiàn)EGR1敲低抑制了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，得出在喉癌患者中EGR1可能與經(jīng)放化療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后喉功能保存呈正相關(guān)，因此，表明EGR1可作為喉咽部腫瘤接受放、化療治療敏感性的有效生物學(xué)指標(biāo)[23]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)RT-PCR和Western方法從基因和蛋白水平檢測(cè)出在阻低USP7后的喉癌細(xì)胞中EGR1表達(dá)上升，因此我們推測(cè)EGR1在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌因子作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)慢病毒USP7敲低后喉癌細(xì)胞的增殖和遷移能力較空白組喉癌細(xì)胞增殖和遷移能力明顯下降，同時(shí)敲低后細(xì)胞組中EGRI表達(dá)較空白組基因及蛋白量表達(dá)上升，因此，我們推測(cè)EGR1可能作為腫瘤抑制基因在喉癌細(xì)胞增殖及遷移方面發(fā)揮作用，因此在未來喉癌的治療中可以從基因治療方面進(jìn)一步研究設(shè)計(jì)提高EGR1的表達(dá)，為喉癌的治療及改善喉癌預(yù)后等方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。