黃開順，曾祥艷，梁文匯，李開祥，廖健明，王 坤

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國家林業(yè)和草原局八角肉桂工程技術(shù)研究中心 廣西木本香料工程技術(shù)研究中心 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530002）

八角（Illicium verum）為八角科（Illiciaceae）八角屬常綠喬木[1]。黃卓民[2]以花色為主要依據(jù)，把八角劃分為紅花八角、淡紅花八角、白花八角和黃花八角4個(gè)品種類群。八角作為栽培歷史悠久的香料兼藥用樹種，主要分布在廣西、云南和廣東的南亞熱帶丘陵山地，其中廣西是世界上最大的八角產(chǎn)地，被譽(yù)為“世界八角之鄉(xiāng)”[3-5]。

八角的主要利用部位為果實(shí)和枝葉。果實(shí)干燥后既是常用的調(diào)料，也是一種傳統(tǒng)中藥材。果實(shí)和鮮葉還可提取揮發(fā)油，鮮葉出油率1%左右，干果出油率10%左右，獲得的油產(chǎn)品俗稱茴香油、茴油或八角油[6-7]。茴香油經(jīng)分離加工和提純可獲得茴腦、草蒿腦和芳樟醇等單離成分[8]，這些成分在食品工業(yè)上可用于調(diào)制和合成各種香精香料，在日化用品工業(yè)上可作為香水、香皂和牙膏等生活用品的加香劑。果實(shí)還含有某些有效成分和活性物質(zhì)，可作為制藥原料，比如莽草酸可用于生產(chǎn)抗禽流感病毒藥物[9-11]。八角粉或茴香油還可用于生產(chǎn)飼料添加劑[12]和抗菌保鮮劑[13]。八角既有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，又有良好的水土保持生態(tài)價(jià)值[14]。

植物各細(xì)胞的生長發(fā)育及其形態(tài)具有季節(jié)性變化。石江濤等[15]研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)樹（Broussonetia pa?pyrifera）次生韌皮部細(xì)胞的形態(tài)、尺寸、數(shù)量和分布在生長季節(jié)內(nèi)有動(dòng)態(tài)變化，呈現(xiàn)明顯的季節(jié)差異。植物油細(xì)胞是一種異形細(xì)胞，屬于分泌組織，細(xì)胞內(nèi)含揮發(fā)油[16-17]。八角葉片中揮發(fā)油的產(chǎn)生、積累和揮發(fā)與油細(xì)胞的發(fā)育有直接關(guān)系，油細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量影響出油率。有關(guān)八角葉片中油細(xì)胞的形態(tài)、分布及其季節(jié)變化研究尚未見報(bào)道。紅花八角是生產(chǎn)中栽培最廣泛、品質(zhì)和產(chǎn)量較高的主栽品種類群之一[18]。本研究以紅花八角鮮葉為材料，采用石蠟切片和顯微觀察的方法，分析葉片中油細(xì)胞的形態(tài)、分布和季節(jié)動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，及其與氮、磷、鉀和硼營養(yǎng)元素含量的相關(guān)性，以期為八角油細(xì)胞發(fā)育規(guī)律的進(jìn)一步研究及茴香油資源的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

八角鮮葉采自廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院八角種質(zhì)資源收集圃（108°21'E，22°55'N），位于廣西南寧市北郊，年均氣溫21.8 ℃，年均降水量1 300 mm，地貌為低丘，海拔95 m[19]。八角樹齡為12年，按常規(guī)措施進(jìn)行施肥管理。選擇10株八角作為定期采樣對(duì)象，均屬于不同株系。按照春（3～5月）、夏（6～8月）、秋（9～11月）和冬（12～2月）4 個(gè)季節(jié)，于2017年7月、10月及2018年1月、5月和8月采集八角鮮葉樣品5批次。每次在每株樹冠向陽部位采摘健康成熟葉片5 張作為石蠟切片材料，采摘后放入保鮮袋，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行固定處理。每株采摘300 g 鮮葉用于氮、磷、鉀和硼營養(yǎng)元素含量的測定。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片制作

采用常規(guī)的石蠟制片方法[20]。取八角葉片中部至邊緣的一部分，用刀片橫切葉片，切取約1 cm2的葉片組織（帶主脈），放入FAA 固定液，浸泡24 h 以上。將葉片組織從固定液中取出，用酸性軟化液軟化，之后依次放入75%酒精4 h、85%酒精2 h、90%酒精2 h、95%酒精2 h、無水乙醇I 2 h、無水乙醇II 2 h，逐級(jí)徹底脫水，二甲苯透明，石蠟滲透包埋；采用Leica RM2245 石蠟切片機(jī)（上海，中國）橫切成厚度4～10μm 的切片，脫蠟至水，番紅-固綠染色，之后依次放入無水乙醇Ⅰ30 s、無水乙醇Ⅱ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min，脫水透明，晾干，中性樹膠封片保存。

1.2.2 顯微觀察與測定

采用Olympus CX32 顯微鏡（中國，廣州）及其TOPVIEW 成像系統(tǒng)觀測石蠟切片中的油細(xì)胞并拍照。每株八角選取1張石蠟切片，觀測葉片厚度和5個(gè)視野的油細(xì)胞數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野所見油細(xì)胞數(shù)量及單個(gè)油細(xì)胞直徑，油細(xì)胞直徑取油細(xì)胞視面垂直兩個(gè)方向長度的平均值。觀測和統(tǒng)計(jì)完成后，計(jì)算油細(xì)胞的大小和分布密度。顯微鏡視野長度固定為720μm。

1.2.3 營養(yǎng)元素含量測定

將每批次鮮葉樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行營養(yǎng)元素含量測定，采用常規(guī)方法測定全氮、全磷、全鉀和全硼的含量[21-23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用于季節(jié)變化分析的油細(xì)胞大小和密度及葉片全氮、全磷、全鉀和全硼含量均取10株的平均值。采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析[24]。分析葉片營養(yǎng)元素含量、油細(xì)胞大小和油細(xì)胞密度隨季節(jié)變化的相關(guān)性時(shí)，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行連續(xù)變化雙變量相關(guān)分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角葉片中油細(xì)胞的分布和形態(tài)特征

葉肉組織中的油細(xì)胞主要分布在柵欄組織和海綿組織中，葉肉中部區(qū)域分布較少（圖1）。靠近上表皮的柵欄組織中油細(xì)胞較多，靠近下表皮的海綿組織中油細(xì)胞較少。除了葉脈間的葉肉組織，各級(jí)葉脈組織中也有較多油細(xì)胞。

圖1 八角葉片橫切面圖Fig.1 Transverse section of I.verum leaves

油細(xì)胞的外觀形態(tài)不規(guī)則，形狀各異，大小不一。在柵欄組織中，油細(xì)胞與旁邊柱狀細(xì)胞緊密豎排，由于被緊密排列的柱狀細(xì)胞夾住，油細(xì)胞多呈柱形、棒形或近橢圓形。在海綿組織中，各種細(xì)胞排列疏松，油細(xì)胞多呈近圓形、半圓形或扇形，并無統(tǒng)一或較一致的形狀。從油細(xì)胞大小看，柵欄組織中的油細(xì)胞明顯大于海綿組織中的油細(xì)胞。在葉脈組織中，油細(xì)胞呈近橢圓形，大小不一。

在柵欄組織和海綿組織中，發(fā)育成熟的油細(xì)胞一般處于完全液泡化的狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不明顯或解體，液泡幾乎充滿細(xì)胞腔，整個(gè)細(xì)胞呈貯油囊狀。葉脈組織中多見未充分液泡化的油細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的液泡貯油囊沒有膨脹至細(xì)胞壁，液泡周圍的細(xì)胞質(zhì)仍明顯可辨。

2.2 八角葉片中油細(xì)胞大小的季節(jié)變化特征

八角株系間，除春季柵欄組織和秋季海綿組織的油細(xì)胞大小外，其他季節(jié)的油細(xì)胞大小均差異顯著（P< 0.05）（表1）。隨著季節(jié)的變化，八角葉片中油細(xì)胞的大小有波動(dòng)變化，柵欄組織和海綿組織中油細(xì)胞大小的季節(jié)波動(dòng)方向和幅度有一定差異（圖2）。在柵欄組織中，油細(xì)胞大小的波動(dòng)幅度較大，呈現(xiàn)出明顯的“升-降-升”變化趨勢，平均值為3 271.39 μm2；夏季到秋季明顯上升，在冬季達(dá)到峰值（4 002.65 μm2），之后明顯下降。在海綿組織中，油細(xì)胞大小的波動(dòng)幅度較小，平均值為1 803.88μm2。

圖2 八角葉片中油細(xì)胞大小的季節(jié)變化Fig.2 Seasonal variation of oil cell size in I.verum leaves

2.3 八角葉片中油細(xì)胞密度的季節(jié)變化特征

八角株系間，各季節(jié)葉片橫切面油細(xì)胞密度均差異顯著（P<0.05），說明由于個(gè)體差異，葉片中油細(xì)胞密度變異大（表1）。

表1 不同季節(jié)八角葉片中油細(xì)胞大小和密度的方差分析Tab.1 Variance analysis on oil cell size and density in I.verum leaves in different seasons

隨著季節(jié)的變化，八角葉片橫切面油細(xì)胞密度發(fā)生較明顯的波動(dòng)變化，柵欄組織和海綿組織中油細(xì)胞密度的季節(jié)波動(dòng)方向一致，均呈現(xiàn)出“降-升-降”的變化趨勢（圖3）。柵欄組織中油細(xì)胞密度的波動(dòng)幅度較大，有急降急升的變化特征，平均值為16.29 個(gè)/mm2，夏季到秋季油細(xì)胞密度明顯降低，冬季又明顯上升。海綿組織中油細(xì)胞密度的波動(dòng)幅度較小，平均值為6.47個(gè)/mm2。

圖3 八角葉橫切面油細(xì)胞密度的季節(jié)變化Fig.3 Seasonal variation of oil cell density in transverse section of I.verum leaves

2.4 營養(yǎng)元素含量分析

八角的生長發(fā)育需要各種營養(yǎng)元素，其葉片中油細(xì)胞的形成、發(fā)育以及揮發(fā)物的積累與營養(yǎng)元素存在一定關(guān)系。

為探索營養(yǎng)元素含量與油細(xì)胞大小和密度的相關(guān)性，在顯微觀察油細(xì)胞形態(tài)和分布的過程中，分析葉片中全氮、全磷、全鉀和全硼含量的動(dòng)態(tài)變化過程。八角葉片中的全氮含量呈現(xiàn)平緩的“升-降-升”變化過程，全磷含量呈現(xiàn)平緩的持續(xù)上升變化過程，全鉀含量呈現(xiàn)平緩的“降-升-降-升”變化過程，全硼含量呈現(xiàn)“急升-緩降-急升”的變化過程（圖4～5）。

圖4 八角葉片中全氮、全磷和全鉀含量的季節(jié)變化Fig.4 Seasonal variations of contents of total nitrogen,total phosphorus and total potassium in I.verum leaves

圖5 八角葉片中全硼含量的季節(jié)變化Fig.5 Seasonal variation of total boron content in I.verum leaves

2.5 八角葉片中油細(xì)胞大小、密度和營養(yǎng)元素含量的相關(guān)性

油細(xì)胞大小與密度均呈負(fù)相關(guān)，說明葉片中油細(xì)胞個(gè)體越大，其分布密度越低。油細(xì)胞大小與全氮、全磷、全鉀和全硼含量均呈正相關(guān)，海綿組織中的油細(xì)胞大小與全硼含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）（表2）。油細(xì)胞密度與全氮、全磷和全硼含量均呈負(fù)相關(guān)，與全鉀含量呈正相關(guān)，柵欄組織中的油細(xì)胞密度與全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

八角葉片中的油細(xì)胞主要分布在脈間區(qū)的柵欄組織和海綿組織中，葉脈組織中也有分布；柵欄組織中分布最多，分布位置多靠近上表皮細(xì)胞，油細(xì)胞個(gè)體較大。這一結(jié)果與一些樹種的研究結(jié)果一致。周存宇等[26]觀察了楠屬（Phoebe）5 種植物葉片中的油細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)油細(xì)胞均分布于柵欄組織，且靠近上表皮；蔡霞等[27]觀察了木蘭科（Magnoliaceae）82 種1 亞種植物葉片中的油細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)油細(xì)胞在葉肉中的分布有3種情況，包括主要分布于柵欄組織、主要分布于海綿組織和均勻散布于整個(gè)葉肉。油細(xì)胞分布于柵欄組織是許多芳香植物常見的一種性狀。

八角葉片柵欄組織和海綿組織中的油細(xì)胞一般都發(fā)育至液泡化，呈貯油囊狀，原有的細(xì)胞質(zhì)解體消失。許多研究表明，液泡化是芳香植物油細(xì)胞發(fā)育成熟的共同特征。侯佳等[28]和初慶剛等[29]分別研究了姜花（Hedychium coronarium）和油樟（Cinna?momum longepaniculatum）油細(xì)胞的發(fā)育過程，均發(fā)現(xiàn)最初油細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生多個(gè)小液泡，之后小液泡融合成大液泡，細(xì)胞質(zhì)被擠壓縮小并逐漸解體，液泡逐漸膨大至充滿整個(gè)細(xì)胞內(nèi)部，形成一個(gè)大的貯油囊，開始積累油狀物。

八角葉片中油細(xì)胞的大小和密度均隨季節(jié)變化而變化，且株系間差異顯著，這種差異性為高含油八角品種的選育提供了基本條件。孫婭東[30]研究表明，芳樟（C.camphoravar.linaloolifera）同家系單株間葉片中的油細(xì)胞形態(tài)存在差異，油細(xì)胞大小的差異性較油細(xì)胞密度大；不同月份間油細(xì)胞密度存在差異，有季節(jié)性變化，與八角葉片中油細(xì)胞的性狀相似。

八角葉片中油細(xì)胞的形狀不規(guī)則，柵欄組織中的油細(xì)胞呈柱形、棒形或近橢圓形，海綿組織中的油細(xì)胞呈近圓形、半圓形或扇形，這兩種組織中成熟的油細(xì)胞一般充分液泡化；葉脈組織中的油細(xì)胞多呈近橢圓形，一般未充分液泡化。葉片柵欄組織、海綿組織和葉脈組織中均有油細(xì)胞存在，柵欄組織中較多，其分布位置多靠近上表皮細(xì)胞，油細(xì)胞個(gè)體較大。不同株系間油細(xì)胞的大小和密度差異顯著。油細(xì)胞的大小和密度隨季節(jié)發(fā)生變化。柵欄組織中油細(xì)胞大小和密度的季節(jié)變化幅度較大，平均值分別為3 271.39 μm2和16.29 個(gè)/mm2；海綿組織中油細(xì)胞大小和密度的季節(jié)變化幅度較小，平均值分別為1 803.88 μm2和6.47 個(gè)/mm2。冬季時(shí)，油細(xì)胞大小和密度均處于較高狀態(tài)，在此季節(jié)制取茴香油較佳。

八角葉片中油細(xì)胞的大小與密度呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)出油細(xì)胞個(gè)體越大、分布密度越小的特征。海綿組織中油細(xì)胞大小與葉片全硼含量呈顯著正相關(guān)，說明葉片吸收和積累硼，可能會(huì)促進(jìn)油細(xì)胞個(gè)體的生長發(fā)育。柵欄組織中油細(xì)胞密度與葉片全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明葉片中氮含量升高可能會(huì)降低油細(xì)胞密度。從相關(guān)性分析獲得啟示，也許可以在實(shí)際生產(chǎn)中通過某種經(jīng)營措施來平衡油細(xì)胞大小和密度，比如通過合理的硼和氮等營養(yǎng)元素的精準(zhǔn)施肥，促使葉片油細(xì)胞大小和密度達(dá)到較高含油率的生長狀態(tài)，可進(jìn)行進(jìn)一步的研究。