王光榮，宋天順，謝婧婧

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

隨著人口的增長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，減少傳統(tǒng)的化石燃料燃燒產(chǎn)生的溫室氣體已成為迫在眉睫的問(wèn)題[1-3]。目前，CO2作為一種潛在的碳資源，其轉(zhuǎn)化固定的方法有很多，主要包括化學(xué)還原[4]、光催化[5]和生物還原等[6]。在現(xiàn)有技術(shù)中，微生物電合成系統(tǒng) (MES) 是利用電活性微生物作為生物催化劑，在陰極表面獲得電子，將CO2還原成有機(jī)化合物的一種新型微生物技術(shù)[7-8]。與生物光合作用和其他CO2固定方法相比，MES具有許多優(yōu)勢(shì)，如：電子受體來(lái)源廣，轉(zhuǎn)化效率高，成本低和反應(yīng)條件溫和[9-10]。

迄今為止，MES的操作效率主要受生物催化劑和電極材料的影響。MES系統(tǒng)中使用的生物催化劑可分為兩大類：混合微生物菌群[10-11]和純菌。其中，純菌的生產(chǎn)力相對(duì)低于混合微生物菌群，但純菌具有清晰的代謝途徑，適合進(jìn)行方法學(xué)的研究。主要的純菌種類包括：Clostridiumljungdahlii[12]、Sporomusaovata[13-15]和Moorellathermoacetica[15]。更多對(duì)于MES的研究集中在對(duì)電極材料的修飾上，如在碳布和三維支架上裝飾導(dǎo)電材料網(wǎng)狀玻璃碳(RVC)[16]或泡沫鎳[17]等，也可以利用析氫材料如碳化鉬修飾電極[18]，增加電子的轉(zhuǎn)移效率，從而提高乙酸鹽的濃度。表面活性劑是一種兩親性的分子[19]，由于其會(huì)改變細(xì)胞表面的親/疏水特性，提高細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)底物的攝取和吸收[20]，幫助底物進(jìn)入細(xì)胞[21]，增加底物利用率等[22-24]，多被用于提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量[19]。但還未見(jiàn)添加表面活性劑對(duì)MES性能的影響，尤其是對(duì)C4產(chǎn)物的影響。通過(guò)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)非離子型表面活性劑聚乙二醇對(duì)C.ljungdahlii的毒性最小，故筆者主要研究不同添加量的聚乙二醇對(duì)MES性能的影響，以期對(duì)MES中如何提高電子傳遞速率提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

C.ljungdahlii菌株是通過(guò)基因手段將丙酮丁醇梭菌的BAPP基因整合到Clostridiumljungdahii菌株的代謝通路中，由上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所提供。

富集培養(yǎng)基(L)：胰蛋白胨10 g,酵母粉16 g,D-果糖10 g,NaCl 0.2 g,半胱氨酸0.3 g；微量元素2 mL,維生素1 mL，刃天青0.5 mL；用HCl調(diào)節(jié)pH為6.0。

陰極液培養(yǎng)基(L): 酵母粉1 g，NH4Cl 1 g, KCl 0.1 g, CaCl20.02 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, NaCl 0.8 g, KH2PO40.1 g, NaHCO31 g, Na2S 0.3 g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.3 g；微量元素10 mL,維生素1 mL,刃天青 0.5 mL；用HCL調(diào)節(jié)pH為 6.0。

陽(yáng)極液培養(yǎng)基(L): NaCl 6 g, KCl 2 g；無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(PETC培養(yǎng)基)50 mL，H2O 950 mL。

PETC培養(yǎng)基(L): NaCl 16 g,KCl 2 g,MgSO4·7H2O 4 g, NH4Cl 20 g, KH2PO42 g，CaCl20.4 g。

1.1.2 儀器

Keithley Instruments 2700數(shù)據(jù)采集器，美國(guó)吉時(shí)利電子有限公司；CHI 1000C、CHI 660E電化學(xué)工作站，CHI 1000C多通道恒電位儀，上海辰華儀器有限公司；H型MES反應(yīng)器，廣西理化有限公司；行穩(wěn)陽(yáng)極，中國(guó)寶雞龍勝有色金屬有限公司；GC-2010 Plus，SHIMADZU氣相色譜儀，UV-1100紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)有限公司；DG 250厭氧工作站，廣州華粵行儀器有限公司；Nafion 117質(zhì)子交換膜，美國(guó)杜邦公司；輔酶II NADP(H)測(cè)試盒，蘇州科銘生物公司；JSM-5900掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社。

1.2 MES反應(yīng)器的構(gòu)建

采用雙室H型反應(yīng)器，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。由圖1可知：用質(zhì)子交換膜將陰、陽(yáng)兩室隔開(kāi)，兩室溶液體積均為250 mL。陰極電極材料為石墨氈，大小為5 cm×5 cm×0.5 cm，行穩(wěn)陽(yáng)極為具有銥和釕涂層的鈦網(wǎng)，其物理表面積為25 cm2，陰陽(yáng)極通過(guò)導(dǎo)線連接至電化學(xué)工作站和數(shù)據(jù)采集器，除實(shí)驗(yàn)因素外，外接電阻均為10 Ω。純度為100%的CO2不斷地通入MES的陰極室。使用多通道恒電位儀將陰極電位設(shè)置為-1.05 V。

圖1 微生物電合成工作原理

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的液體活化

配置富集培養(yǎng)基，并于115 ℃滅菌30 min，冷卻后放置在厭氧工作站中除氧，從-80 ℃冰箱取出C.ljungdahlii菌株，以10%的接種量活化，活化4～5次，當(dāng)吸光度值(OD600)達(dá)到0.6時(shí)，向MES反應(yīng)器的陰極室接入10 mL的菌液。

1.3.2 MES反應(yīng)器的搭建與設(shè)置

本實(shí)驗(yàn)共搭建10組MES反應(yīng)器，分別設(shè)為空白對(duì)照(CF)，以及添加0.5%、1.0%、2.0%和4.0%不同體積分?jǐn)?shù)聚乙二醇(PEG)的實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置2組平行實(shí)驗(yàn)，每天取樣1 mL，測(cè)定其OD600，然后將樣品通過(guò)0.22 μm水系濾膜注入樣品瓶中，在樣品瓶中加入5 μL 體積分?jǐn)?shù)為50%的HCL，混勻并測(cè)定其產(chǎn)物濃度。

1.4 分析方法

1.4.1 產(chǎn)物及H2濃度的測(cè)定與計(jì)算

在實(shí)驗(yàn)前后，用配備有熱導(dǎo)檢測(cè)器的氣相色譜儀測(cè)量H2濃度。在正常工作的MES反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行H2含量的測(cè)定。色譜柱為Porapak Q填充柱。具體檢測(cè)方法：氣化室溫度為120 ℃；檢測(cè)器溫度為100 ℃；色譜柱溫度為60 ℃，保留時(shí)間為5 min，無(wú)升溫程序。測(cè)量前使用N2(純度為99.999%)連續(xù)吹掃30 min使系統(tǒng)脫氧。

使用配備有氫離子火焰檢測(cè)器的氣相色譜儀分析MES反應(yīng)器溶液中的產(chǎn)物。色譜柱型號(hào)：Agilent HP-INNOWax毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm×0.25 μm)。氣化室溫度180 ℃，檢測(cè)器溫度為270 ℃。色譜柱升溫程序：起始柱溫為60 ℃，保留0.5 min；按每分鐘10 ℃升溫至200 ℃，保留0.5 min；共計(jì)15 min。載氣為N2(純度為99.999%)，流速為1.32 mL/min。

1.4.2 線性伏安曲線(LSV)的測(cè)量

在室溫下，在標(biāo)準(zhǔn)三電極電化學(xué)池中進(jìn)行線性掃描伏安法的測(cè)量。所有測(cè)試均在上述陰極液培養(yǎng)基介質(zhì)中以陰極作為工作電極，行穩(wěn)陽(yáng)極作為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極。

1.4.3 還原當(dāng)量的測(cè)定

使用輔酶Ⅱ NADP(H)測(cè)試盒對(duì)每組實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行還原當(dāng)量的測(cè)定(按照操作說(shuō)明書進(jìn)行)。

1.4.4 生物膜的電鏡表征(SEM)

陰極表面的表面形態(tài)，根據(jù)參考文獻(xiàn)[25]的方法固定化后，利用電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG 對(duì)于MES 電化學(xué)性能的影響

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，筆者對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的電流和庫(kù)倫效率(CEs)進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：接種后立即產(chǎn)生電流，并在1.5 d左右變得相對(duì)穩(wěn)定。1.0% PEG的電流最高，為10 mA左右；其次是0.5% PEG，其電流約為8.5 mA；再次是2.0% PEG，前5天電流均為8.0 mA左右，然后開(kāi)始緩慢下降，可能是生物膜的增厚和底物濃度的增加導(dǎo)致反應(yīng)速度降低[26-28]，到第7天，2.0%PEG的電流為6 mA，和CF的電流相似；4% PEG的電流最低。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)計(jì)算產(chǎn)物庫(kù)倫效率。由圖2(b)可知：1.0% PEG，2.0% PEG和0.5% PEG的庫(kù)倫效率較為相似，約為(42±1)%，然后是CF 39.5%，4.0% PEG 的庫(kù)倫效率最低為34.3%。且4.0% PEG組的電流和庫(kù)倫效率均低于CF，而其余實(shí)驗(yàn)組均高于CF，可能是4.0% PEG抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，從而降低了電子的傳遞速率。

圖2 添加不同體積分?jǐn)?shù)PEG的電化學(xué)性能：電流量和庫(kù)倫效率

2.2 PEG對(duì)MES產(chǎn)物的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天監(jiān)測(cè)反應(yīng)器溶液中的OD600和產(chǎn)物濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3和表1。由圖3(a)可知：接種后，陰極培養(yǎng)基的OD600在某種程度上代表了培養(yǎng)基中微生物的生長(zhǎng)。由圖3(a)可知：所有MES的初始OD600約為0.005，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)1% PEG 的OD600最高，為0.076，其次是0.5% PEG的OD600為0.070和2.0% PEG的OD600為0.066，均高于CF的OD600為0.060，而4.0% PEG的OD600要低于CF，僅為0.054。通過(guò)圖3(b)、(c)和(d)觀察到的MES反應(yīng)器中的產(chǎn)物主要是乙酸鹽，丁酸鹽和少量乙醇。其中，1.0% PEG的最高乙酸產(chǎn)率為(0.73±0.11) g/L，其次是0.5% PEG，為(0.52±0.01) g/L，2.0% PEG為(0.51±0.01) g/L和CF(0.47±0.02) g/L，最低的是4.0%PEG，為(0.38±0.02) g/L。由表1可知：1.0% PEG中的乙酸鹽產(chǎn)率為每天0.105 g/L，是CF組的 1.57倍，其次是0.5% PEG，為每天0.075 g/L和2.0% PEG，為每天0.073 g/L，分別是CF的1.12和1.09倍，4.0% PEG的乙酸產(chǎn)率最低為0.054 g/L，是CF的0.81倍。此外，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也產(chǎn)生了乙醇,乙醇有先增加后減少的趨勢(shì)，但產(chǎn)物的濃度差異不大。

圖3 添加不同體積分?jǐn)?shù)PEG的MES實(shí)驗(yàn)：OD600以及乙酸、乙醇和丁酸產(chǎn)率

表1 添加不同體積分?jǐn)?shù)PEG的OD600最大值和產(chǎn)物速率

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還檢測(cè)出丁酸作為C4產(chǎn)物且持續(xù)積累，結(jié)果見(jiàn)圖3(d)。由圖3(d)可知：1.0%PEG的MES的丁酸質(zhì)量濃度最高，為(0.18± 0.01) g/L，其次是2.0%PEG,為(0.17± 0.01) g/L和0.5%PEG，為(0.16± 0.01) g/L，均要高于CF組的丁酸質(zhì)量濃度(0.14± 0.01) g/L，而4%PEG的丁酸質(zhì)量濃度最低，僅為(0.11± 0.01) g/L。相應(yīng)的，1.0%PEG最高的丁酸產(chǎn)率為每天0.024 g/L，是CF的1.2倍。最后發(fā)現(xiàn)4.0%的PEG的產(chǎn)物(乙酸和丁酸)均要低于CF，可能是4.0%的添加量過(guò)高，對(duì)菌株的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用[19]。這主要是由于C.ljungdahlii中丁酸途徑的導(dǎo)入，可以利用來(lái)自陰極的H2作為MES中良好的電子載體，產(chǎn)生長(zhǎng)鏈的C4產(chǎn)物。

2.3 生物膜分析

不同體積分?jǐn)?shù)PEG的SEM圖見(jiàn)圖4。由圖4可知：在陰極培養(yǎng)基中加入PEG有利于促進(jìn)微生物的附著。圖4中碳?xì)直砻娓街逊e的桿形或梭形菌株為本實(shí)驗(yàn)中的C.ljungdahlii菌株在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中形成的生物膜，從碳?xì)直砻婢甑母街闆r可以側(cè)面表示在MES反應(yīng)器中菌株的生長(zhǎng)情況。其中圖4(c)中1.0%的PEG的實(shí)驗(yàn)組材料上附著的微生物最多；其次是圖4(b)中0.5%的PEG實(shí)驗(yàn)組和圖4(d)中2.0%的PEG實(shí)驗(yàn)組，圖4(e)中4.0%的PEG實(shí)驗(yàn)組和圖4(a)中CF的附著的微生物相差不大，在碳纖維中觀察到較少的細(xì)菌。綜上，由圖4可以看出：低濃度PEG有利于微生物的附著，而高濃度的PEG濃度同樣也不利于微生物的附著，這也和筆者的產(chǎn)物數(shù)據(jù)符合。

圖4 CF，0.5% PEG，1.0% PEG，2.0% PEG和4.0% PEG的SEM

2.4 PEG影響MES性能的機(jī)制分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，除了分析其產(chǎn)物數(shù)據(jù)和生物膜，筆者也對(duì)其他的參數(shù)進(jìn)行了分析，主要分析了線性伏安曲線、H2濃度和還原當(dāng)量。

線性伏安曲線(圖5)可以反映不同體積分?jǐn)?shù)PEG對(duì)催化活性的影響。由圖5可知：在-1.05 V時(shí)，0.5% PEG、1.0% PEG、2.0% PEG和4.0% PEG的陰極電流密度分別增加到-0.52、-0.86、-0.54和-0.36 mA/m2，具有1.0% PEG的MES的陰極電流密度比CF(-0.42 mA/m2)高2.1倍。陰極電流密度的增加表明：通過(guò)向陰極室中添加低濃度的PEG可以提高陰極的電子轉(zhuǎn)移能力，加快CO2的還原速度。而4.0%的PEG的電流和電流密度均要低于CF，可能是添加高濃度PEG有一定的細(xì)胞毒性，從而抑制了菌株生長(zhǎng)。

圖5 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后不同體積分?jǐn)?shù)的PEG的線性伏安曲線

同時(shí)，筆者在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前和結(jié)束后(圖6)均測(cè)量了實(shí)驗(yàn)組的H2濃度。從圖6(a)可以看出：在不使用C.ljungdahlii的情況下，H2產(chǎn)率隨著PEG添加量的增加而增加，均遠(yuǎn)高于CF組。4.0% PEG具有最高的H2產(chǎn)量(1.56%)。由圖6(b)可以看出：在C.ljungdahlii存在下，添加PEG的實(shí)驗(yàn)組在MES中產(chǎn)生的H2高于CF獲得的H2，其中1.0% PEG 析出H2濃度最高，為0.121%，是CF(0.042%)的2.8倍；其次是0.5%PEG(0.085%)，2.0% PEG(0.073%)和4.0% PEG(0.058%)，分別是CF的2.02、1.74和1.38倍。

圖6 實(shí)驗(yàn)前后不同體積分?jǐn)?shù)PEG的H2濃度

由于PEG是一種非離子型表面活性劑，加入PEG可提高溶液中H2的產(chǎn)率，這和文獻(xiàn)[29-30]報(bào)道的現(xiàn)象一致。而實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各實(shí)驗(yàn)組的H2濃度均低于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，可能是因?yàn)镸ES系統(tǒng)中的微生物會(huì)持續(xù)消耗H2[31]，C.ljungdahlii可以利用來(lái)自陰極的H2作為MES中良好的電子載體。而2.0% PEG和4.0% PEG的產(chǎn)H2濃度并沒(méi)有隨著PEG添加量的增加而增加，可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)高的表面活性劑濃度反而影響了其本身的表面活性[32-33]，從而影響了反應(yīng)器中H2的產(chǎn)生。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的還原當(dāng)量見(jiàn)圖7。由圖7可知：低濃度PEG的還原當(dāng)量較高，包括1.0%和0.5%的PEG，其次是2.0%的PEG，而4.0%的PEG和CF的還原當(dāng)量相對(duì)較低。相應(yīng)的，1.0% PEG的乙酸和丁酸累積達(dá)到的產(chǎn)量最高，分別為(0.73±0.11) g/L和(0.18±0.01) g/L，其中，MES丁酸產(chǎn)率是CF的1.21倍，乙酸產(chǎn)率是CF的1.58倍。在其他添加PEG的MES中觀察到了相同的趨勢(shì)。隨著H2濃度的提高，丁酸與乙酸的增加率之差變大。這種現(xiàn)象表明在MES系統(tǒng)中H2含量即還原力在產(chǎn)物調(diào)節(jié)中起著重要作用。

圖7 不同體積分?jǐn)?shù)PEG的還原當(dāng)量

由以上結(jié)果可以說(shuō)明：加入低濃度的PEG有助于H2的產(chǎn)生，從而提高代謝通路中的還原力及電子傳遞效率。在-1.05 V電勢(shì)下會(huì)發(fā)生H2析出，從而提高電子傳輸速率和MES的性能。在筆者的研究中獲得的產(chǎn)品不僅限于乙酸、丁酸產(chǎn)率，產(chǎn)量每天為0.024 g/L，這主要與引入丁酸代謝途徑有關(guān)。在C.ljungdahlii的代謝途徑表明(圖8)，C.ljungdahlii包括Wood-Ljungdahl途徑，可通過(guò)該途徑將CO2還原為乙酰-CoA，而乙酰-CoA可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇[34]。在此過(guò)程中，乙醇的產(chǎn)生是可逆的，這解釋了為什么乙醇的產(chǎn)生如此之低，并且在MES系統(tǒng)中未觀察到乙醇的積累。通過(guò)將丁酸鹽生產(chǎn)途徑引入C.ljungdahlii，還可以將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丁酸。乙酸和丁酸均由乙酰-CoA轉(zhuǎn)化而來(lái)，因此，乙酸和丁酸的產(chǎn)量同時(shí)增加。丁酸生產(chǎn)需要C.ljungdahlii代謝途徑中的高濃度質(zhì)子。質(zhì)子來(lái)自兩種不同的途徑。質(zhì)子可能來(lái)源于陽(yáng)極中的水電解，通過(guò)H+依賴的ATPase酶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞膜，促使細(xì)胞生長(zhǎng)并伴隨ATP的合成[35]。質(zhì)子也可以由H2生成，通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞膜，經(jīng)過(guò)雙功能電子傳輸氫化酶轉(zhuǎn)化為質(zhì)子[36-37]。而PEG的存在可以改善H2的產(chǎn)生，從而為丁酸鹽的生產(chǎn)提供更多的質(zhì)子，提高還原當(dāng)量。

圖8 C. ljungdahlii的代謝路徑[34]

3 結(jié)論

研究了非離子表面活性劑PEG的添加量對(duì)MES性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為1.0%的PEG的MES性能最好，其乙酸和丁酸質(zhì)量濃度能分別達(dá)到(0.73±0.117) g/L和(0.18±0.01) g/L，是CF的1.58和1.21倍。其機(jī)制可能是由于低濃度的PEG的細(xì)胞毒性相對(duì)較低，同時(shí)可以增加H2產(chǎn)生，從而提高了電子的傳遞效率，增加產(chǎn)品濃度。而4.0%PEG的丁酸鹽濃度僅為(0.11± 0.01) g/L，要低于CF，可能是4%的添加量過(guò)高，抑制了菌株的生長(zhǎng)。