周旭華 劉鵬程 王 偉 丁 靜 蘇 悅#

(1.長治職業(yè)技術學院生物工程系，山西 長治 046000；2.杭州秀川科技有限公司，浙江 杭州 311121)

吡啶是目前雜環(huán)化合物中開發(fā)應用范圍最廣的化合物之一，是醫(yī)藥、農(nóng)藥的重要基礎原料，可生產(chǎn)依諾沙星、巴洛沙星、米氮平、鹽酸右哌甲酯、吡蟲啉和煙嘧磺隆等數(shù)十種藥物。吡啶為典型的含氮雜環(huán)化合物，是一個氮原子取代了苯環(huán)上的一個碳原子而形成的化合物，故又稱氮苯。吡啶分子中，雜氮原子上未共用電子對不僅未參與環(huán)上π電子共軛體系的形成，反而因雜氮原子很強的電負性，吸引環(huán)上電子，致使環(huán)上電子云密度急劇下降，形成缺π電子結構，妨礙了氧從分子中獲得電子，使其生物降解性能大大降低。并且，吡啶對微生物具有強抑制性，導致生化處理系統(tǒng)常規(guī)活性污泥難以對其進行處理。

目前，處理含吡啶廢水常用方法有物理法、化學法和生物法[1]。生物法具有處理成本低、降解具有特異性和無二次污染等優(yōu)勢，因此應用廣泛。目前，篩選出的吡啶降解菌已有多株，如動膠菌樣申氏菌(Shinellazoogloeoides)[2]、叢毛單胞菌屬(Comamonassp.)[3]、根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)[4]、貪銅菌屬(Cupriavidussp.)[5]和藤黃微球菌屬(Micrococcusluteus)[6]等。這些菌株均可在無鹽或低鹽的環(huán)境中實現(xiàn)對吡啶的降解，而在高鹽環(huán)境中的表現(xiàn)缺乏研究。制藥廢水通常為高鹽廢水，處理含吡啶的高鹽制藥廢水的前提是降解菌株具有高耐鹽性。

本研究擬從高鹽環(huán)境中篩選具有吡啶高效降解效果的嗜耐鹽微生物，探究菌株生理生化特性及吡啶降解性能，為今后菌株在實際高鹽吡啶廢水中的工程應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和培養(yǎng)基

菌株分離樣品來源于南海海水，鹽度為3.5%，儲存在無菌器皿中，于4 ℃低溫保藏。

無機鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g/L、CaCl21.8 g/L、MgSO4·7H2O 6.6 g/L、KCl 0.6 g/L、NaHCO30.2 g/L、SrCl234.0 mg/L、KBr 0.1 g/L、H3BO322.0 mg/L、Na2SiO34.0 mg/L、NaF 2.4 mg/L，pH 7.2。

PY液體培養(yǎng)基：無機鹽培養(yǎng)基中加入吡啶1.0 g/L、NaCl 30.0 g/L。本研究中鹽度以NaCl質量分數(shù)計，即PY液體培養(yǎng)基的鹽度為3.0%。

PY固體培養(yǎng)基：PY液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20.0 g/L。

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0 g/L。

1.2 菌株富集、分離及純化

菌株富集：將海水樣品按照20.0%(體積分數(shù))的接種量接種于PY液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min下振蕩培養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯渾濁時，進行多次轉接，轉接3次后得到富集液。

菌株分離：采用梯度稀釋涂布法，將富集液梯度稀釋，隨后取各梯度的樣品0.1 mL，用無菌的玻璃涂布棒均勻涂布到PY固體培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)箱內倒置培養(yǎng)，定期觀察，直至出現(xiàn)明顯的單菌落。

菌株純化：挑取形態(tài)不同的單菌落至無菌的LB固體培養(yǎng)基上，多次劃線，得到純的單菌落。

1.3 吡啶降解菌的復篩和吡啶含量測定

將初篩菌株接種至PY液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min下振蕩培養(yǎng)3 d。吸取10.0 mL菌懸液12 000 r/min下離心5 min，吸取上清液，采用氣相色譜—質譜聯(lián)用法[7]測定上清液中吡啶含量，并計算降解率。

1.4 菌株多相分類學研究

1.4.1 菌株基因型特性

采用16S rRNA基因通用引物27F(5’-GAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGAC-3’)進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，采用TA克隆法獲得高質量16S rRNA基因序列。測序結果提交至EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)進行序列比對，選取相似性較高的序列用Neighbor-Joining法進行分析，采用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

采用高效液相色譜法[8]測定菌株基因組的鳥嘌呤和胞嘧啶含量。

1.4.2 菌株形態(tài)學及生理生化特性研究

將菌種按照1.0%的接種量，接種于LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)一定時間，待菌落形態(tài)明顯，觀察其形態(tài)特征，并對其進行革蘭氏染色，查看其染色特征。

生化特性鑒定參見文獻[9]。

1.5 吡啶降解特性研究

將目標菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min下培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用滅菌的無機鹽培養(yǎng)基洗滌菌體2次，并制成600 nm處吸光度(OD600)為2.0的種子液。

一般實驗條件：將種子液按照1.0%的接種量接種于PY液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min下培養(yǎng)4 d，定期監(jiān)測菌株OD600及體系中吡啶含量?？疾禧}度、溫度、碳源影響時，分別改變相應變量。

1.6 菌株的馴化

將種子液按照1.0%的接種量接種于PY液體培養(yǎng)基中，逐步提高PY液體培養(yǎng)基中吡啶含量，吡啶每次增加0.5 g/L，直至增加至3.0 g/L，完成馴化。將馴化完成的菌種接種于吡啶分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L的PY液體培養(yǎng)基中，考察吡啶降解效果。

1.7 菌株降解吡啶的穩(wěn)定性

將馴化后新鮮的H21菌液按照1.0%的接種量接種于PY液體培養(yǎng)基中，當菌液培養(yǎng)至OD600約1.0時，此為第1次傳代。依次傳代20次，取傳代第5、10、15、20次的H21菌液接種于PY液體培養(yǎng)基中，以未傳代的馴化菌株H21作為對照，測定菌株H21對吡啶的降解效果，以評估菌株H21在高鹽脅迫下對吡啶的降解穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 降解菌的篩選與鑒定

2.1.1 菌株篩選

Milk-run系統(tǒng)的運行模式是配送人員使用設備通過固定的路線在固定的時間段內進行小批量零件配送。Milk-run系統(tǒng)的路線規(guī)劃在設計時必須重點考慮，合理的路線規(guī)劃能有效提高其效率，保證系統(tǒng)的可實施性。一般Milk-run供貨路線模式可以分為以下幾種模式：兩站式、中心倉庫式、多重?？奎c式、差異化?？奎c式。車間Milk-run供貨模式多采用1∶n的中心倉庫式。

樣品經(jīng)富集及菌株分離后，共篩選到5株能以吡啶為唯一碳源及氮源，并能在3.0%鹽度下生長的菌株，其中菌株H21的降解效果最好(降解率約56%)，之后對其進行特性研究。

2.1.2 菌種鑒定

將菌株H21的16S rDNA序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫，進行在線比對，發(fā)現(xiàn)菌株H21與高山芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis)DSM 21631T的序列最相近，相似度為99.1%。通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株H21與高山芽孢桿菌在同一個分支上。經(jīng)測定，菌株H21的鳥嘌呤和胞嘧啶摩爾分數(shù)為42.8%，與高山芽孢桿菌一致。據(jù)此可初步鑒定菌株H21歸屬于高山芽孢桿菌。

菌株H21的主要脂肪酸為異構型十五烷酸、反異構型十五烷酸和異構型珍珠酸，與高山芽孢桿菌的主要脂肪酸類型一致；菌株H21的主要極性脂為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和雙磷脂酰甘油，也與高山芽孢桿菌的主要極性脂類型一致。

菌株H21為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)呈現(xiàn)為白色、直徑2～3 mm、邊緣整齊、不透明、表面凸起。溫度生長范圍為10～50 ℃，最適為35 ℃；鹽度生長范圍為0～8.0%，最適為1.0%；pH生長范圍為5.0～9.5，最適為7.0；兼性厭氧。

菌株H21不能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，不能水解酪蛋白，但能水解酪氨酸。過氧化氫酶、氧化酶、半乳糖苷酶、淀粉酶活性、賴氨酸脫羧酶和苯丙氨酸脫氨酶活性呈陽性，V-P實驗呈陰性。菌株H21與高山芽孢桿菌在生理生化特性上也一致。

結合基因型、化學分類及表型特征，鑒定菌株H21為高山芽孢桿菌。

2.2 菌株H21的降解特性

2.2.1 鹽度影響

圖1 鹽度對菌株H21的生長及吡啶降解效果的影響Fig.1 Effect of salinity on the growth and pyridine degradation of strain H21

2.2.2 溫度影響

由圖2可見，隨著溫度的升高，菌株H21對吡啶的降解率先升高后降低，30～35 ℃時吡啶降解效果最佳。這與其他報道的吡啶降解菌的最適降解溫度相近，如動膠菌樣申氏菌BC026的最適吡啶降解溫度為30～35 ℃[12]，假單胞菌(Pseudomonassp.)ZX01和節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)ZX07的最適吡啶降解溫度為35 ℃[13]?，F(xiàn)有報道中吡啶降解菌株最適降解溫度大多在30～40 ℃，當溫度超過40 ℃時，微生物細胞內某些具有特定功能的蛋白酶受到抑制，甚至產(chǎn)生不可逆的破壞，從而使降解活性降低甚至消失。菌株H21在高溫(50 ℃)下依然表現(xiàn)出較高的吡啶降解率(約50%)。王書萍等[14]從土壤分離到42 ℃下具有很好降解效率的菌株，該菌株也被鑒定為芽孢桿菌屬?？梢姡挎邨U菌屬對溫度具有較高的耐受潛力。

圖2 溫度對菌株H21的生長及吡啶降解效果的影響Fig.2 Effect of temperature on the growth and pyridine degradation of strain H21

2.2.3 碳源影響

以0.5 g/L葡萄糖、乙酸鈉、乳酸鈉為額外碳源加入PY液體培養(yǎng)基中。由圖3可見，額外碳源均會促進菌株H21的生長和對吡啶的降解，不同的碳源對菌株H21的生長影響差別不大，但對吡啶降解的促進效果有區(qū)別。乙酸鈉對吡啶的降解促進作用最明顯，3 d內吡啶降解率為86.8%。一方面，可能是乙酸鈉作為小分子碳源，明顯有效促進了菌株的生長進而促進了吡啶的降解；另一方面，可能是乙酸鈉作為胞外電子供體，可產(chǎn)生胞內電子供體，進而促進吡啶的降解。據(jù)報道，吡啶降解是由兩步單加氧反應激發(fā)的，吡啶通過單加氧反應生成2-羥基吡啶，2-羥基吡啶進一步通過單加氧反應生成2，3-二羥基吡啶，后續(xù)的反應使得吡啶開環(huán)，轉化為非穩(wěn)定性物質，生成生物易降解的羧酸類物質(如丁二酸和甲酸)。每個單加氧反應都需要氧分子和胞內電子供體，而胞內電子供體可由易被生物氧化的胞外電子供體(如乙酸、甲酸)經(jīng)氧化產(chǎn)生。當乙酸作為電子供體時，可促進吡啶的降解，并且最初的單加氧反應速率與電子供體的濃度成正比[15]。

圖3 碳源對菌株H21的生長及吡啶降解效果的影響Fig.3 Effect of carbon sources on the growth and pyridine degradation of strain H21

2.2.4 馴化后菌株的吡啶降解效果

當吡啶為1.0 g/L時，馴化后菌株H21對吡啶的降解效果較馴化前無明顯的差異(見圖4)，可能是因為菌株本身已經(jīng)較耐受該濃度下的吡啶。隨著吡啶濃度的增加，馴化后菌株H21對吡啶的降解優(yōu)勢逐漸發(fā)揮出來，馴化后菌株H21對不同濃度的吡啶的降解能力明顯提高，這說明馴化明顯提高了菌株對吡啶的耐受性。菌株的降解能力除跟自身的特性有關外，逐步增加底物濃度或長期接觸底物對菌株進行馴化也可增強其降解能力，如全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3經(jīng)馴化后對吡啶的降解效果較馴化前提高近1倍[16]。

圖4 馴化前后菌株H21對吡啶的降解效果Fig.4 Effect of strain H21 on pyridine-degrading before and after domestication

2.2.5 菌株對吡啶的降解穩(wěn)定性

由圖5可見，第5、10、15、20次傳代的菌株H21對吡啶的降解率分別為95.6%、94.2%、93.7%、94.4%，而未經(jīng)傳代的菌株H21對吡啶的降解率為96.3%。經(jīng)過多次傳代后，馴化菌株H21對吡啶仍然保持90%以上的降解能力，說明馴化后菌株H21對吡啶降解具有較好的穩(wěn)定性。

圖5 傳代次數(shù)對菌株H21降解吡啶的影響Fig.5 Effect of passage times on pyridine degradation of strain H21

3 結 論

(1) 從海洋環(huán)境中篩選得到高耐鹽的吡啶降解菌株H21，鑒定為高山芽孢桿菌，其生長最適溫度為35 ℃、最適pH為7.0、最適鹽度為1.0%，最高耐受8.0%的鹽度。

(2) 菌株H21對吡啶降解的最適溫度為30～35 ℃、最適鹽度為0.5%～1.0%，在5.0%鹽度或50 ℃下仍具有50%左右的吡啶降解率。

(3) 額外碳源會促進菌株H21對吡啶的降解，乙酸鈉對吡啶的降解促進尤為明顯。

(4) 馴化可明顯提高菌株H21對高濃度吡啶的耐受性，其降解能力可穩(wěn)定遺傳。