李 銳， 尚 霄， 尚春樹， 常利芳， 閆 蕾， 白建榮

(1.山西農業(yè)大學農學院， 太原 030031； 2.山西強盛種業(yè)有限公司， 太原 030031)

玉米大約于16世紀從美洲引入我國[1]，遺傳基礎相對狹窄一直是制約我國玉米育種的瓶頸。因此，種質的擴增、改良和創(chuàng)新是玉米育種的核心問題[2-3]。目前玉米種質資源與日俱增，其數(shù)目的龐大給種質保存、評價、研究和利用增加了工作量及難度。因此，為提高種質資源的管理質量和效率，構建玉米核心種質十分必要和迫切。

澳大利亞學者Frankel在1984年第一次提出了核心種質的想法， 即采取一定的取樣方法，用盡可能少的種質材料最大可能代表整個資源的遺傳信息和多樣性[4]。早期對于核心種質的構建主要基于表型數(shù)據(jù)，雖易操作，但信息量少、易受環(huán)境影響而誤差大。分子標記技術信息量大，不受環(huán)境影響，已經(jīng)成為構建核心種質的主要方法[5]。目前，分子標記手段已經(jīng)成功應用到玉米[6-9]、水稻[10]、籽用西瓜[11]、大白菜[12]、建蘭[13]、野生山胡椒[14]等多種作物核心種質的構建中。

由于復雜的地理環(huán)境與生產條件，山西省形成了5個玉米生態(tài)種植區(qū)域[15]，幾乎包括了全國乃至全世界的玉米生態(tài)類型，每年審定的品種在100個以上。多年來，玉米育種團隊在收集了大量國內外玉米種質的基礎上，改良、培育了許多符合不同生態(tài)條件的優(yōu)良自交系，這些自交系在很大程度上代表了山西玉米種質的特點。因此，構建山西玉米自交系的核心種質庫具有實踐指導意義，也是亟待解決的問題。本研究在用SSR分子標記對這些優(yōu)良自交系進行遺傳多樣性分析的基礎上，構建其核心種質，將為這些種質的保存、重點研究和有效利用提供可靠的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1試驗材料

224份玉米自交系由山西強盛種業(yè)有限公司提供, 其中包括目前生產上主要推廣品種先玉335、先玉508、先玉696和鄭單958的親本自交系PH 6 WC(先玉335，先玉508，先玉696的母本)、PH 4 CV(先玉335父本)、PHB 1 M(先玉696的父本)、PH 5 AD(先玉508的父本)、鄭58(鄭單958母本)和昌7-2(鄭單958父本)。

1.1.2SSR引物

采用中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準(NY/T 1432-2014《玉米品種鑒定DNA指紋方法》)的20 對核心引物和20 對輔助核心引物[16]。

1.2 實驗方法

1.2.1SSR分析及聚類分析

DNA 提取、SSR分析及聚類分析方法參見李銳等[17]的方法。

1.2.2取樣方法

本試驗采用多次聚類結合優(yōu)先取樣法。首先根據(jù)所有種質遺傳相似度，將樣品進行聚類形成樹狀圖。在聚類樹狀圖中，按照一定的相似度進行分類。每一類中首先全部入選標準測驗種和具有特異等位變異材料，然后從類內隨機抽取一個樣品保留進入下一輪聚類分析，若類內只有一個樣品則該樣品直接保留進入下一輪聚類分析。將所有保留的樣品再次聚類，按之前同樣的方法取樣；再進入下一輪聚類、取樣，循環(huán)，直至所取樣品量達到理想取樣。

1.2.3核心種質代表性檢驗和評價

用等位變異數(shù)、多態(tài)位點數(shù)、基因多樣性、多態(tài)信息含量等指標評價原始種質和核心種質的遺傳多樣性。

2 結果與分析

2.1 核心種質庫的構建及數(shù)據(jù)分析

利用40個SSR標記的171個等位變異，對224個自交系進行遺傳距離聚類。在相似系數(shù)大約為0.71處可分為五大聚類群, 依據(jù)各聚類支中含有的不同種質類群的代表性自交系,確定類群的名稱(圖1)。從圖中看出，瑞德群、蘭卡斯特群是兩個最大的群，二者數(shù)量之和超過了材料的90%；有10份材料屬于唐四平頭群；另有10個自交系的類群歸屬不明確，定為其他群。蘭卡斯特群可明顯看出，有335父本群、696與508父本群和其他蘭卡斯特群，即有亞類分化趨勢。在此基礎上，再用最小距離逐步抽樣法進行構建核心種質，即遺傳距離小于一定數(shù)值的種質將首先被淘汰，但每次抽樣都保留標準測驗種和具有特異等位變異的自交系。共抽樣8次，每次抽樣構建自交系核心種質的遺傳多樣性如表1。由表1可以看出，隨著抽樣種質數(shù)目的減少，PIC和遺傳多樣性參數(shù)呈增加趨勢；等位基因數(shù)與多態(tài)性位點減少極少。分析每次抽樣后聚類圖的類群結構發(fā)現(xiàn)，抽樣6的聚類圖仍然保持原始樣本的類群劃分(圖2 )，但抽樣7和抽樣8的聚類圖則不能保持原始樣本的類群結構。因此，抽樣6為最合適的核心種質群體。

表1 聚類優(yōu)先取樣下各備選核心種質遺傳多樣性指數(shù)

圖1 基于SSR的224份原始玉米自交系聚類分析

圖2 基于SSR 標記的68份玉米核心自交系聚類分析

2.2 核心種質的確認與評價

原始種質224個自交系，依據(jù)30.36% 取樣比例構建的核心種質包含 68個自交系，剩下的 156 個自交系為保留種質。對3組種質的等位變異數(shù)、基因多樣性、多態(tài)信息量、多態(tài)位點數(shù)這 4 個遺傳參數(shù)進行比較，結果如表2所示，核心種質的多態(tài)信息含量(0.50)和基因多樣性(0.556 0)高于原始種質(0.44；0.500 2)，等位變異數(shù)(4.20)和多態(tài)位點數(shù)(168)略小于原始種質(4.28；171)。同時，核心種質的這4個遺傳參數(shù)均大于保留種質。3 組種質的4個遺傳參數(shù)t檢驗結果顯示，核心種質與原始種質、保留種質和原始種質均無明顯差異(p>0.05)(表3)。以30.36% 的取樣比例構建的包含 68個玉米自交系的核心種質能夠充分代表原始種質的遺傳多樣性。

表2 核心種質、保留種質與原始種質遺傳參數(shù)的比較

表3 核心種質、保留種質與原始種質遺傳參數(shù)的t檢驗

3 討 論

本研究根據(jù)30.36% 取樣比例構建了224份玉米自交系的核心種質。3 組種質的4個遺傳參數(shù)t檢驗結果表明，核心種質與原始種質、保留種質和原始種質之間均無明顯差異，充分反映了該核心種質代表了原始種質的遺傳多樣性，保留種質也保留了原始種質的遺傳多樣性。

核心種質構建是種質資源研究的熱點，構建核心種質的目的是以最小的樣本數(shù)最大限度地代表原始樣本群體的遺傳多樣性，構建的核心種質要有代表性、異質性和多樣性、類型齊全。但是核心種質遺傳代表性和數(shù)量之間存在非線性關系[17]，因此，取樣策略和取樣比例是構建核心種質的關鍵。本研究的原始樣本劃分為4類雜種優(yōu)勢群，而玉米自交系的雜種優(yōu)勢類群的劃分是玉米種質分析的主要內容和品種親本組配的重要依據(jù)，因而構建的核心種質也要保留原雜種優(yōu)勢類群的特點，核心種質構建要考慮實際育種的需求和應用，構建好的核心種質要有利于種質的分析、保存和利用，不能盲目照搬已有的方法。因此，本研究采用多次聚類結合優(yōu)先取樣法，即在構建玉米自交系種質的核心種質時，雖然采用最小遺傳距離逐步抽樣法進行，但是，首先抽選標準測驗種將它們作為類群劃分的標準，使每次的抽樣能反映其代表性；然后在其他抽樣時先入選有特異等位變異的材料，因為它們代表了原始樣本的異質性和多樣性。每次循環(huán)聚類都按照這個原則進行。當進行到第7次抽樣聚類圖顯示和原始樣本聚類圖的類群劃分不一樣時，就認為第6次抽樣是合適的。研究結果顯示，原始樣本瑞德群的數(shù)量最多，但是核心種質中瑞德群的數(shù)量減少了很多，說明原始瑞德群中重復、冗余的樣本較多；核心種質中其他群的數(shù)量相比原始群中其他群的數(shù)量相差不多。另外，本研究沒有預先劃定取樣比例，完全根據(jù)逐步取樣后能否完全反映原始樣本的遺傳多樣性為前提，這和李自超等[18]認為各物種適宜的核心種質規(guī)模應按照具體物種的遺傳多樣性來定的思路是一致的。綜上表明，本研究采用的策略具有合理性和實用性。構建的核心種質將有利于育種人員對育種材料的評價、保存、研究和在育種中的有效利用。