裴自友， 程天靈， 溫輝芹， 辻本壽， 李 雪， 王宏兵， 張立生

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 太原 030031； 2.鳥(niǎo)取大學(xué)干燥地研究中心， 日本 鳥(niǎo)取 680-0001)

染色體重組是對(duì)基因組重新排列組合的過(guò)程，對(duì)育種和遺傳研究都有重要意義。普通小麥(TriticumaestivumL.)是異源六倍體(2 n=6 X=42)，染色體組為AABBDD。在普通小麥的減數(shù)分裂中只有同源染色體可以發(fā)生配對(duì)重組，這種類二倍化的減數(shù)分裂配對(duì)機(jī)制是受小麥5號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的主效基因Ph1控制。操控Ph基因誘導(dǎo)小麥-外源部分同源染色體配對(duì)重組，形成高遺傳補(bǔ)償性的染色體易位，是利用近緣屬種優(yōu)良基因的重要方式[1-3]。

有些擬斯卑爾脫山羊草(Ae.speltoides，SS)可以在5 B染色體存在的情況下提高小麥×擬斯卑爾脫山羊草雜種F1的部分同源染色體配對(duì)水平。原因是擬斯卑爾脫山羊草含有抑制Ph基因效應(yīng)的顯性上位基因(PhI，又稱高配對(duì)基因)，該基因能夠誘導(dǎo)普通小麥與小麥近緣種屬的部分同源染色體配對(duì)和交換[4-5]。Dvorak等[6]定位了擬斯卑爾脫山羊草中能夠抑制Ph1的兩個(gè)主效QTL(Su1-Ph1和Su2-Ph1)，分別位于3 S長(zhǎng)臂和7 S長(zhǎng)臂上，利用Su1-Ph1抑制系統(tǒng)定向誘導(dǎo)部分同源染色體間的重組交換[7]。

Chen等[8]將擬斯卑爾脫山羊草中PhI基因轉(zhuǎn)移到普通小麥中國(guó)春上，育成含有PhI基因的普通小麥中國(guó)春高配對(duì)材料(Chinese Spring PhI，以下簡(jiǎn)稱CS-PhI)，利用該材料與硬簇麥雜交育成了小麥-簇毛麥T 5 VS·5 VL-5 DL易位系[9]。

目前對(duì)高配對(duì)材料CS-PhI的染色體組成僅進(jìn)行了染色體C帶分析，初步定為小麥4 D易位[8]，但尚無(wú)準(zhǔn)確的定論，且沒(méi)有有效的連鎖標(biāo)記。隨著技術(shù)的進(jìn)步，利用基因組原位雜交(Genomic in situ hybridization, GISH)、重復(fù)序列探針雙色或多色熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)相結(jié)合可以更高效地識(shí)別染色體的身份[10-14]。

為了明確小麥高配對(duì)材料CS-PhI的分子細(xì)胞遺傳學(xué)組成，本研究利用基因組原位雜交和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(AAG)5為探針的FISH技術(shù)鑒定CS-PhI中小麥與擬斯卑爾脫山羊草的易位情況。同時(shí)開(kāi)展白粉病抗性基因推導(dǎo)與成株期抗性鑒定，旨在了解其遺傳多樣性，為今后的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

小麥高配對(duì)材料CS-PhI由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞所提供，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院優(yōu)質(zhì)小麥課題組保存。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(AAG)5由日本葛萊娜有限公司合成，擬斯卑爾脫山羊草和普通小麥中國(guó)春由日本鳥(niǎo)取大學(xué)農(nóng)學(xué)部植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

用于苗期小麥白粉菌抗譜比較分析的39個(gè)攜帶已知抗病基因品種(系)、2個(gè)感病對(duì)照(阿夫和Chancellor)和23個(gè)不同毒性的小麥白粉菌菌株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所周益林研究員提供。

成株期鑒定所用白粉病菌株為混合菌株，具體見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

1.2 方 法

1.2.1根尖有絲分裂中期染色體制片

參照郭明慧等[16]的方法進(jìn)行根尖有絲分裂中期染色體制片。

1.2.2GISH分析

用tetramethyl-rhodamine-5-dUTP標(biāo)記的擬斯卑爾脫山羊草基因組DNA為探針，普通小麥中國(guó)春基因組DNA作封阻DNA，雜交程序參照Cho等[17]的方法。

1.2.3順序FISH-GISH分析

參照Cho等[17]和溫輝芹等[18]的方法進(jìn)行順序原位雜交，首先用tetramethyl-rhodamine-5-dUTP標(biāo)記合成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(AAG)5進(jìn)行FISH分析，觀察、照相后將信號(hào)洗脫, 再以1.2.2方法進(jìn)行GISH分析，用Olympus BX 61熒光顯微鏡對(duì)同一細(xì)胞觀察、照相。

1.2.4苗期抗白粉病基因推導(dǎo)

試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室進(jìn)行，具體參考曹學(xué)仁等[19]的方法。

1.2.5成株期白粉病抗性鑒定

試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽(yáng)試驗(yàn)基地優(yōu)質(zhì)小麥課題組白粉病鑒定圃進(jìn)行，具體參照程天靈等[15]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子細(xì)胞學(xué)鑒定

根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體GISH結(jié)果表明，CS-PhI染色體數(shù)目2 n=42，含一對(duì)小麥與擬斯卑爾脫山羊草小片段雙末端易位染色體，易位位置為小麥染色體的端部，且易位染色體為一對(duì)隨體染色體(見(jiàn)圖1)。

注：箭頭表示小麥-擬斯卑爾脫山羊草易位染色體。

對(duì)根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體同一制片進(jìn)行順序FISH和GISH分析，探針?lè)謩e為重復(fù)序列(AAG)5和擬斯卑爾脫山羊草基因組DNA，GISH時(shí)普通小麥中國(guó)春基因組DNA作封阻，結(jié)果見(jiàn)圖2。研究發(fā)現(xiàn)，圖2-A箭頭所示易位染色體在著絲粒附近FISH帶型豐富，根據(jù)小麥(AAG)5標(biāo)準(zhǔn)帶型，進(jìn)一步確定易位涉及的小麥染色體為6 B。圖2-B箭頭標(biāo)示小麥-擬斯卑爾脫山羊草易位染色體，易位的擬斯卑爾脫山羊草染色體兩端均有GISH帶型(信號(hào)相對(duì)較弱)。

圖2 CS-PhI同一根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體順序FISH-GISH

2.2 白粉病抗性鑒定

2.2.1苗期小種抗性鑒定與抗性基因推導(dǎo)

基因推導(dǎo)結(jié)果(表1)表明，CS-PhI對(duì)3個(gè)小種表現(xiàn)免疫或高抗，對(duì)其他小種表現(xiàn)中感或高感。初步看，CS-PhI與Pm4c或Pm3b的抗譜有些相似，但考慮品種的背景不同，因此是否是新的基因還需進(jìn)行綜合分析研究。

表1 對(duì)小麥白粉菌不同菌株的反應(yīng)型

2.2.2成株期抗性鑒定

成株期白粉病抗病性鑒定結(jié)果表明，感病對(duì)照京雙16為8級(jí)，CS-PhI病級(jí)為0級(jí)，表現(xiàn)免疫。

3 討 論

以基因組DNA為探針的GISH推動(dòng)了外源染色體鑒定，GISH和以單鏈寡核苷酸為探針的FISH技術(shù)的緊密結(jié)合，促進(jìn)了染色體的精準(zhǔn)鑒定，已廣泛用于小麥種質(zhì)材料分析[20-21]。

在小麥起源中由于S染色體組與B染色體組親緣關(guān)系較近，因此為了保證鑒定結(jié)果的可靠性，預(yù)備試驗(yàn)中以S基因組為探針，對(duì)已知含殺配子染色體(gametocidal chromosome)的小麥-擬斯卑爾脫山羊草易位系CS-Gc1a(大片段易位)和CS-Gc1b(小片段易位)[22]進(jìn)行準(zhǔn)確的GISH鑒定。

本研究根據(jù)普通小麥中國(guó)春(AAG)5標(biāo)準(zhǔn)染色體分子核型[12-13]，結(jié)合GISH結(jié)果，明確CS-PhI為雙末端小片段擬斯卑爾脫山羊草易位系，易位涉及的小麥染色體為6 B，尚不能確定易位的擬斯卑爾脫山羊草染色體為第幾條S染色體，因此，CS-PhI中易位染色體為T 6 BS·S/T 6 BL·S。對(duì)CS-PhI材料的識(shí)別和開(kāi)展PhI基因的標(biāo)記研究具有極其重要的價(jià)值。已建立了中國(guó)春與CS-PhI遺傳標(biāo)記群體，并對(duì)F2單株分析染色體減數(shù)分裂中期染色體配對(duì)情況(含PhI基因會(huì)出現(xiàn)多價(jià)體)，為進(jìn)一步篩選與PhI基因緊密連鎖標(biāo)記的分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

Chen等[8]通過(guò)染色體C-分帶分析發(fā)現(xiàn)，CS-PhI的4 D染色體異常，判斷其為小麥4 D與S染色體的易位系。本研究中易位的小麥染色體不是4 D而是6 B，推測(cè)可能是所用材料的差異所致。CS-PhI分不同的品系，組合來(lái)源均為(中國(guó)春×擬斯卑爾脫山羊草)/中國(guó)春BC2F3后代單株，GISH鑒定發(fā)現(xiàn)在鳥(niǎo)取大學(xué)辻本壽教授研究室保存的CS-PhI材料中沒(méi)有外源基因信號(hào)，可能為小麥-擬斯卑爾脫山羊草漸滲系(另文發(fā)表)。

目前小麥白粉病在育種和生產(chǎn)上面臨著抗源單一化和抗病性容易喪失的嚴(yán)峻現(xiàn)狀[23]，因此有必要挖掘與利用不同基因資源，其中利用小麥成株抗性是未來(lái)實(shí)現(xiàn)品種持久抗性的最佳選擇[24]。劉成等[25]研究表明，來(lái)源于小麥近緣植物的抗白粉病基因有41個(gè)，其中包括來(lái)自擬斯卑爾脫山羊草的Pm12、Pm32和Pm53。本研究中，CS-PhI表現(xiàn)苗期對(duì)絕大多數(shù)白粉病生理小種感病、成株期抗病，為成株期抗病優(yōu)異材料，后期應(yīng)進(jìn)行白粉病抗性遺傳分析。

CS-PhI株高120 cm左右，穎殼有絨毛，有抽穗遲、晚熟、農(nóng)藝性狀較差，抗寒性弱等缺點(diǎn)，不宜直接作育種親本，為了利用其成株期高抗白粉病、耐熱等優(yōu)異特性，已通過(guò)與長(zhǎng)麥6686和長(zhǎng)7080等栽培品種雜交改良，培育出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗白粉病新種質(zhì)。