左 杰， 張國(guó)棟， 李紫倩， 浦 杰， 屈 燕， 區(qū) 智

(1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心， 昆明 650224；2.大理州云龍縣漕澗林場(chǎng)， 云南 大理 672711)

威氏綠絨蒿(MeconopsiswilsoniiGrey-Wilson)是罌粟科(Papaveraceae)綠絨蒿屬(Meconopsis)的多年生草本植物，綠絨蒿為綠絨蒿屬植物的總稱，是云南八大名花之一，被歐洲人稱為世界名花，其花朵碩大，花色豐富，具有很高的藥用價(jià)值，是亟待開(kāi)發(fā)的園林植物與藥用植物[1]，威氏綠絨蒿花大且多，呈藍(lán)紫色至紫紅色，高可達(dá)1.5 m，常分布于海拔3 000 m以上區(qū)域，屬珍稀瀕危物種，具有巨大的育種潛力[2]。

目前，有關(guān)綠絨蒿無(wú)性繁殖研究報(bào)道較少，技術(shù)尚不成熟，主要靠種子進(jìn)行繁殖。與植物的其他營(yíng)養(yǎng)器官相比，種子的發(fā)育一直處于相對(duì)封閉的環(huán)境中，其表面特征受環(huán)境影響較小[3]，應(yīng)用體視鏡和掃描電鏡分別對(duì)種子外部形態(tài)及種皮的微形態(tài)特征進(jìn)行初步觀察研究，旨在豐富、完善對(duì)威氏綠絨蒿植物的認(rèn)識(shí)。

種子萌發(fā)的程度是影響出苗率的關(guān)鍵因素之一[4]，在種子萌發(fā)試驗(yàn)之前通過(guò)測(cè)定種子的生理生化指標(biāo)以及種子的基本生物學(xué)特征，能夠更好地判斷種子是否具備萌發(fā)的潛力。同時(shí)，進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中提高種子的萌發(fā)率對(duì)綠絨蒿屬的后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究至關(guān)重要，因此迫切需要盡快找到促進(jìn)綠絨蒿種子萌發(fā)的措施。植物激素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用，適宜種類與適宜濃度的激素可有效促進(jìn)植物種子的萌發(fā)[5]。近年來(lái)，關(guān)于植物外源激素對(duì)種子萌發(fā)影響的研究很多，但對(duì)于不同種類外源激素處理威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)種子表型特征、生理特性及不同濃度GA3、6-BA、NAA、SA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響進(jìn)行初步研究，以期找到適宜的激素及其濃度促進(jìn)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)，為威氏綠絨蒿引種馴化和播種栽培提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

威氏綠絨蒿種子于2019年9月22日采自云南轎子雪山(海拔4 344.1 m，102°48′49″～102°58′50″E，26°00′23″～26°10′20″N)，采后放置陰涼通風(fēng)處自然干燥，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子基本生物學(xué)特性

種子大小、千粒重測(cè)定：選用發(fā)育良好的成熟種子，分別置于體視顯微鏡和掃描電鏡下觀察，拍照。

種子含水量測(cè)定：稱取1 g種子，放入80 ℃烘箱，每隔12 h稱量并記錄種子的質(zhì)量，直到稱重樣品3次恒重為止。設(shè)3組重復(fù)，計(jì)算含水量，結(jié)果取平均值。

含水量(%)=[(樣品烘前質(zhì)量-樣品烘后質(zhì)量)/樣品烘前質(zhì)量]×100%；

種子吸水率測(cè)定：隨機(jī)選取3 000粒種子，分為3組，用電子天平稱重后放置于2 mL離心管，加純水反復(fù)震蕩后靜置，分別于吸水2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時(shí)取出種子，用吸水紙擦干種子表面水分并稱量，計(jì)算平均值。

吸水率(%)=[(浸種后重量-浸種前重量)/浸種前重量]×100%。

1.2.2種子生理指標(biāo)的測(cè)定

在進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)之前測(cè)定種子的生理生化指標(biāo)。MDA含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、CAT活性和POD活性的測(cè)定均參照李合生[6]的實(shí)驗(yàn)方法，稍有改動(dòng)。

1.2.3種子萌發(fā)試驗(yàn)

隨機(jī)選取2 520粒威氏綠絨蒿種子，放入裝有1%的過(guò)氧化氫溶液的2 mL離心管中消毒30 s，用蒸餾水洗凈殘余過(guò)氧化氫。用4種激素進(jìn)行處理，每種激素分別設(shè)置7個(gè)不同濃度(ck為0 mg·L-1處理)(表1)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每重復(fù)30粒種子。用相應(yīng)激素處理浸種24 h，在墊有濕潤(rùn)濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中播種，播種后放入20 ℃、光照12 h·d-1、濕度70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(前48 h做暗處理)。

表1 不同激素及其濃度設(shè)置

每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況，以胚根伸出種子長(zhǎng)度等于種子長(zhǎng)度的1/2視為萌發(fā)。測(cè)定指標(biāo)包括：發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

圖表繪制軟件為Oringin Pro 9.0，顯著性差異分析軟件為SPSS 25。

2 結(jié)果與分析

2.1 威氏綠絨蒿種子表型特征

電鏡及體視鏡觀察，威氏綠絨蒿成熟種子近腎形，種子干燥后種皮黑褐色，具有較深的、蜂窩狀孔的凹陷和短條紋狀、近網(wǎng)狀皺褶。經(jīng)測(cè)量，威氏綠絨蒿的種子長(zhǎng)度為(1.19±0.11)mm，寬度為(0.73±0.12)mm；種子千粒重為(0.31±0.01)g，屬于小型種子；含水量為(8.74±0.2)%(圖1)。

注：體視鏡下種子形態(tài)(1)、(2)；掃描電鏡下種子形態(tài)(3)、(4)。

2.2 威氏綠絨蒿種子吸水規(guī)律

由圖2可知，隨著純水浸種時(shí)間的延長(zhǎng)，威氏綠絨蒿種子吸水速度先快后慢，呈現(xiàn)出3個(gè)階段，在0～2 h為急劇吸水階段，吸水率從0上升到36.7%，平均每小時(shí)吸水速率為18.35%。在2～12 h為緩慢吸水階段，吸水率從36.7%上升到最大值70.07%，平均吸水速率為3.34%。12～24 h為飽和吸水階段，吸水率維持動(dòng)態(tài)恒定。

圖2 威氏綠絨蒿種子吸水率隨吸水時(shí)間變化規(guī)律

2.3 威氏綠絨蒿種子生理特性

經(jīng)測(cè)定，未經(jīng)激素處理的威氏綠絨蒿種子中丙二醛含量為(5.10±0.81)mmol·g-1；可溶性蛋白含量為(46.37±0.67)mg·g-1；超氧化物歧化酶活性為(559.33±17.80)U·g-1；過(guò)氧化物酶活性為(83.33±22.68)U·g-1；過(guò)氧化氫酶含量為(2 777.78±444.88)U·g-1。

2.4 不同濃度GA3對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

由圖3可知，100 mg·L-1、200 mg·L-1、800 mg·L-1GA3處理均能提高威氏綠絨蒿種子的發(fā)芽率，當(dāng)GA3濃度為800 mg·L-1時(shí)促進(jìn)種子萌發(fā)的效果最顯著(p<0.05)。當(dāng)GA3濃度在200～800 mg·L-1之間時(shí)均能顯著提高種子的發(fā)芽勢(shì)(p<0.01)，400 mg·L-1和800 mg·L-1GA3濃度處理過(guò)的威氏綠絨蒿種子平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間均顯著縮短(p<0.05)，800 mg·L-1GA3處理顯著提高了種子發(fā)芽指數(shù)(p<0.05)?？傮w來(lái)看，GA3處理能夠促進(jìn)種子萌發(fā)，800 mg·L-1GA3促進(jìn)效果最顯著(p<0.05)，相較于ck發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)分別增加了23.89%、12.56%和2.03，但平均發(fā)芽時(shí)間縮短了8.43 d，發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間提前了5 d。

圖3 不同濃度GA3對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.5 不同濃度NAA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

由圖4可知，20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1NAA在一定程度上提高了種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，80 mg·L-1NAA顯著提高了種子的發(fā)芽指數(shù)(p<0.05)，而3 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1NAA處理則降低了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。各濃度NAA處理對(duì)種子平均發(fā)芽時(shí)間影響均不顯著(p>0.05)，40 mg·L-1、80 mg·L-1NAA處理縮短了種子的發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間?？傮w來(lái)看，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的各濃度NAA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，但都沒(méi)有達(dá)到顯著性差異水平(p>0.05)，80 mg·L-1NAA處理更有利于種子萌發(fā)。

圖4 不同濃度NAA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.6 不同濃度6-BA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

由圖5可知，經(jīng)低濃度6-BA處理后的威氏綠絨蒿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)較ck變化不大(p>0.05)，當(dāng)6-BA濃度超過(guò)10 mg·L-1時(shí)，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)隨激素濃度的增加而降低(p<0.05)；在發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間以及發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間上，各濃度6-BA處理的種子相對(duì)于ck無(wú)顯著性差異(p>0.05)?？傮w來(lái)看，低濃度6-BA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)影響不明顯，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到20 mg·L-1時(shí)，開(kāi)始抑制威氏綠絨蒿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，使發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別降低67.12%和6.12%，當(dāng)6-BA 濃度為40 mg·L-1時(shí)對(duì)種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)抑制更明顯，分別降低了69.37%和14.7%。

圖5 不同濃度6-BA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.7 不同濃度SA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

由圖6可知，當(dāng)SA處理濃度在25～400 mg·L-1之間時(shí)，除發(fā)芽指數(shù)外其他各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)均與ck無(wú)顯著性差異(p>0.05)，當(dāng)SA濃度為800 mg·L-1時(shí)不僅降低了種子的發(fā)芽率，并且延長(zhǎng)了種子的平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間?？傮w來(lái)看，低濃度SA處理對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響不明顯，而高濃度的SA處理則抑制了威氏綠絨蒿種子的萌發(fā)，800 mg·L-1濃度的SA處理種子時(shí)，對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生了明顯的抑制。

圖6 不同濃度SA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.8 各激素處理促進(jìn)種子萌發(fā)效果綜合比較

由圖7可知，選取對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)促進(jìn)效果最好的激素濃度，綜合比較各激素對(duì)種子萌發(fā)促進(jìn)效果的差異。在發(fā)芽率的促進(jìn)效果上，800 mg·L-1GA3>80 mg·L-1NAA>25 mg·L-1SA>1 mg·L-16-BA；在發(fā)芽勢(shì)的促進(jìn)效果上，800 mg·L-1GA3>80 mg·L-1NAA，25 mg·L-1SA和1 mg·L-16-BA降低了發(fā)芽勢(shì)；在縮短平均發(fā)芽天數(shù)上，800 mg·L-1GA3>1 mg·L-16-BA>80 mg·L-1NAA>25 mg·L-1SA；在縮短發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間上，800 mg·L-1GA3>1 mg·L-16-BA>80 mg·L-1NAA，25 mg·L-1SA增加的發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間；在提升發(fā)芽指數(shù)上，800 mg·L-1GA3>80 mg·L-1NAA>1 mg·L-16-BA>25 mg·L-1SA。

圖7 各激素處理促進(jìn)種子萌發(fā)效果綜合比較

3 討 論

種子作為重要的繁殖器官，在植物適應(yīng)環(huán)境及繁殖過(guò)程中都具有重要作用。種子的形態(tài)特征具有相對(duì)穩(wěn)定性，種子微形態(tài)結(jié)構(gòu)與種子水分的吸收、種子的生活力以及種子的傳播、壽命、萌發(fā)速度的快慢和萌發(fā)率有著密切的聯(lián)系，種子的形態(tài)和質(zhì)量還能影響種子的散布距離[2]。袁長(zhǎng)春[7]利用掃描電鏡對(duì)32種綠絨蒿種子進(jìn)行觀察研究，根據(jù)外種皮表面的紋飾和附屬物的差異，將綠絨蒿植物的種皮紋飾分為條紋型、網(wǎng)紋型、褶皺型和泡狀型。綜合體視鏡和掃面電鏡的觀察，威氏綠絨蒿種子近腎形，在低倍放大時(shí)，外種皮表面具有較密集的褶皺，且部分褶皺呈片塊狀，在高倍放大后，片塊狀褶皺呈雜亂狀的擠在一起，并有部分細(xì)絲狀物交織在一起，屬于褶皺型種子。

種子從收獲到播種都需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的儲(chǔ)藏，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，種子會(huì)逐漸失去活力，發(fā)芽率明顯下降，甚至難以萌發(fā)。在播種之前測(cè)定種子的生理生化反應(yīng)能更準(zhǔn)確地反應(yīng)出種子的活力和內(nèi)在品質(zhì)，也能更好的對(duì)儲(chǔ)藏中的種子是否能順利萌發(fā)做一個(gè)預(yù)判。目前關(guān)于種子活力的測(cè)定方法常用的有3種：第一是進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)；第二是測(cè)定生理生化指標(biāo)；第三是復(fù)合逆境法測(cè)定[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定種子的部分生理生化指標(biāo)以及進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，證明威氏綠絨蒿種子在進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)前是處于正常狀態(tài)且具有活力的種子。

種子休眠是指具有生活力的種子在適宜的萌發(fā)條件下仍不能萌發(fā)的現(xiàn)象, 大多數(shù)植物種子有或強(qiáng)或弱的休眠特性[9]。綠絨蒿生長(zhǎng)于海拔2 500～5 500 m的高山上，高山上氣候多變，休眠可以防止種子在不適于自身生長(zhǎng)的外界環(huán)境條件下萌發(fā)，種子休眠可能是綠絨蒿的一種生存策略[10]。不管這種策略是否存在，種子休眠都給綠絨蒿的科研栽培和生產(chǎn)栽培上帶來(lái)諸多不便，因此，科研和生產(chǎn)上都迫切需求找到破除綠絨蒿種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)的有效措施。

周健[11]研究表明，種子休眠可能是由于植物角質(zhì)層和柵欄層的結(jié)構(gòu)影響種子種皮透性所引起的。賴小連等[12]研究認(rèn)為，夏臘梅萌發(fā)困難是由于種皮堅(jiān)硬，透水性較弱而導(dǎo)致。本研究表明，威氏綠絨蒿種子吸水速度先快后慢，浸種12 h種子吸水達(dá)到飽和并趨于穩(wěn)定，飽和時(shí)吸水率為67.65%，說(shuō)明威氏綠絨蒿種子在萌發(fā)時(shí)不存在吸水障礙。另外，威氏綠絨蒿種子經(jīng)純水浸泡12 h后吸水率趨于飽和，這可為以后研究激素及其他物質(zhì)溶液對(duì)威氏綠絨蒿種子作用效果時(shí)種子浸泡處理時(shí)間的確定提供參考。

外源激素能夠?qū)χ参锓N子萌發(fā)起到促進(jìn)或抑制的作用[13]，常見(jiàn)的外源激素有GA3、NAA、6-BA、SA等。

GA3可促進(jìn)糊粉層細(xì)胞合成淀粉酶，淀粉酶能夠促進(jìn)胚乳中淀粉的水解，為胚的生長(zhǎng)發(fā)育提供物質(zhì)和能量，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)[14]。200～300 mg·L-1GA3處理可提高長(zhǎng)果綠絨蒿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，縮短平均發(fā)芽時(shí)間[15]，當(dāng)使用200 mg·L-1的GA3處理頂果木種子時(shí)，可顯著提高其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，但濃度提升至300 mg·L-1時(shí)對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)效果不如200 mg·L-1的處理好[16]。本實(shí)驗(yàn)表明，低濃度GA3對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)影響不顯著(p>0.05)，但當(dāng)GA3濃度達(dá)到800 mg·L-1時(shí)，可以極顯著地提高種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，降低平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間(p<0.05)。但屈燕等[17]研究表明，100 mg·L-1GA3對(duì)總狀綠絨蒿種子萌發(fā)促進(jìn)最顯著。因此可以推斷，不同種類的綠絨蒿對(duì)不同外源激素處理的最適濃度不同。

NAA是一種廣譜型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑, 能夠促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和擴(kuò)大, 誘導(dǎo)不定根的形成[18]。研究表明，一定濃度的NAA預(yù)處理能夠提高植物種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)[19-21]，也有研究表明，NAA可抑制植物種子萌發(fā)[22]。本實(shí)驗(yàn)表明，NAA對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)影響不顯著，80 mg·L-1NAA雖可提高種子的萌發(fā)，但未能達(dá)到顯著性差異水平(p>0.05)，這可能是由于促進(jìn)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的NAA濃度高于80 mg·L-1。

6-BA是一種非植物內(nèi)源的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)細(xì)胞的分裂，濃度適宜時(shí)可促進(jìn)種子的萌發(fā)，如0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-16-BA均能促進(jìn)花葉莧菜種子萌發(fā)，但6-BA 濃度為2 mg·L-1時(shí)則對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生了抑制[23]。對(duì)于威氏綠絨蒿來(lái)說(shuō)，1 mg·L-1、2 mg·L-1、5 mg·L-1和10 mg·L-16-BA處理的種子在發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)上相對(duì)于ck均無(wú)顯著性差異(p>0.05)，但濃度大于20 mg·L-1時(shí)反而會(huì)降低種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，因此6-BA可能對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)無(wú)促進(jìn)作用，相反，20 mg·L-1以上濃度還會(huì)抑制種子萌發(fā)。

SA是植物界普遍存在的酚類化合物，對(duì)植物有積極的生理效應(yīng), 被認(rèn)為是一種新的植物內(nèi)源激素[24]。達(dá)清璟等[25]研究表明，不同濃度的SA處理能夠?qū)偁罹G絨蒿種子萌發(fā)產(chǎn)生不同程度的促進(jìn)和抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)SA濃度小于800 mg·L-1時(shí)對(duì)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)影響不明顯(p>0.05)，當(dāng)濃度提升至800 mg·L-1時(shí)，SA不僅極顯著地降低了種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)(p<0.01)，還增加了平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間(p<0.01)，這說(shuō)明總狀綠絨蒿與威氏綠絨蒿種子萌發(fā)特性并不相同。

4 結(jié) 論

威氏綠絨蒿種子近腎形，屬褶皺型種子。種子的休眠并不來(lái)源于吸水障礙，經(jīng)過(guò)不同濃度GA3、NAA、6-BA、SA處理后，發(fā)芽率最高的是GA3處理組，當(dāng)GA3濃度達(dá)到800 mg·L-1時(shí)，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最高，平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間最短。因此，為提升種子萌發(fā)效率，在播種威氏綠絨蒿時(shí)，建議預(yù)先采用800 mg·L-1GA3浸種24 h處理，6-BA和SA不適宜作為威氏綠絨蒿播種時(shí)的外源添加激素。