左 杰， 張國棟， 李紫倩， 浦 杰， 屈 燕， 區(qū) 智

(1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心， 昆明 650224；2.大理州云龍縣漕澗林場， 云南 大理 672711)

威氏綠絨蒿(MeconopsiswilsoniiGrey-Wilson)是罌粟科(Papaveraceae)綠絨蒿屬(Meconopsis)的多年生草本植物，綠絨蒿為綠絨蒿屬植物的總稱，是云南八大名花之一，被歐洲人稱為世界名花，其花朵碩大，花色豐富，具有很高的藥用價值，是亟待開發(fā)的園林植物與藥用植物[1]，威氏綠絨蒿花大且多，呈藍(lán)紫色至紫紅色，高可達(dá)1.5 m，常分布于海拔3 000 m以上區(qū)域，屬珍稀瀕危物種，具有巨大的育種潛力[2]。

目前，有關(guān)綠絨蒿無性繁殖研究報道較少，技術(shù)尚不成熟，主要靠種子進(jìn)行繁殖。與植物的其他營養(yǎng)器官相比，種子的發(fā)育一直處于相對封閉的環(huán)境中，其表面特征受環(huán)境影響較小[3]，應(yīng)用體視鏡和掃描電鏡分別對種子外部形態(tài)及種皮的微形態(tài)特征進(jìn)行初步觀察研究，旨在豐富、完善對威氏綠絨蒿植物的認(rèn)識。

種子萌發(fā)的程度是影響出苗率的關(guān)鍵因素之一[4]，在種子萌發(fā)試驗(yàn)之前通過測定種子的生理生化指標(biāo)以及種子的基本生物學(xué)特征，能夠更好地判斷種子是否具備萌發(fā)的潛力。同時，進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)過程中提高種子的萌發(fā)率對綠絨蒿屬的后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究至關(guān)重要，因此迫切需要盡快找到促進(jìn)綠絨蒿種子萌發(fā)的措施。植物激素對植物的生長發(fā)育有著重要作用，適宜種類與適宜濃度的激素可有效促進(jìn)植物種子的萌發(fā)[5]。近年來，關(guān)于植物外源激素對種子萌發(fā)影響的研究很多，但對于不同種類外源激素處理威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的研究鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)通過對種子表型特征、生理特性及不同濃度GA3、6-BA、NAA、SA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響進(jìn)行初步研究，以期找到適宜的激素及其濃度促進(jìn)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)，為威氏綠絨蒿引種馴化和播種栽培提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

威氏綠絨蒿種子于2019年9月22日采自云南轎子雪山(海拔4 344.1 m，102°48′49″～102°58′50″E，26°00′23″～26°10′20″N)，采后放置陰涼通風(fēng)處自然干燥，儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子基本生物學(xué)特性

種子大小、千粒重測定：選用發(fā)育良好的成熟種子，分別置于體視顯微鏡和掃描電鏡下觀察，拍照。

種子含水量測定：稱取1 g種子，放入80 ℃烘箱，每隔12 h稱量并記錄種子的質(zhì)量，直到稱重樣品3次恒重為止。設(shè)3組重復(fù)，計算含水量，結(jié)果取平均值。

含水量(%)=[(樣品烘前質(zhì)量-樣品烘后質(zhì)量)/樣品烘前質(zhì)量]×100%；

種子吸水率測定：隨機(jī)選取3 000粒種子，分為3組，用電子天平稱重后放置于2 mL離心管，加純水反復(fù)震蕩后靜置，分別于吸水2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時取出種子，用吸水紙擦干種子表面水分并稱量，計算平均值。

吸水率(%)=[(浸種后重量-浸種前重量)/浸種前重量]×100%。

1.2.2種子生理指標(biāo)的測定

在進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)之前測定種子的生理生化指標(biāo)。MDA含量、可溶性蛋白含量、SOD活性、CAT活性和POD活性的測定均參照李合生[6]的實(shí)驗(yàn)方法，稍有改動。

1.2.3種子萌發(fā)試驗(yàn)

隨機(jī)選取2 520粒威氏綠絨蒿種子，放入裝有1%的過氧化氫溶液的2 mL離心管中消毒30 s，用蒸餾水洗凈殘余過氧化氫。用4種激素進(jìn)行處理，每種激素分別設(shè)置7個不同濃度(ck為0 mg·L-1處理)(表1)，每個處理3次重復(fù)，每重復(fù)30粒種子。用相應(yīng)激素處理浸種24 h，在墊有濕潤濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中播種，播種后放入20 ℃、光照12 h·d-1、濕度70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(前48 h做暗處理)。

表1 不同激素及其濃度設(shè)置

每天定時統(tǒng)計種子萌發(fā)情況，以胚根伸出種子長度等于種子長度的1/2視為萌發(fā)。測定指標(biāo)包括：發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時間、發(fā)芽啟動時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

圖表繪制軟件為Oringin Pro 9.0，顯著性差異分析軟件為SPSS 25。

2 結(jié)果與分析

2.1 威氏綠絨蒿種子表型特征

電鏡及體視鏡觀察，威氏綠絨蒿成熟種子近腎形，種子干燥后種皮黑褐色，具有較深的、蜂窩狀孔的凹陷和短條紋狀、近網(wǎng)狀皺褶。經(jīng)測量，威氏綠絨蒿的種子長度為(1.19±0.11)mm，寬度為(0.73±0.12)mm；種子千粒重為(0.31±0.01)g，屬于小型種子；含水量為(8.74±0.2)%(圖1)。

注：體視鏡下種子形態(tài)(1)、(2)；掃描電鏡下種子形態(tài)(3)、(4)。

2.2 威氏綠絨蒿種子吸水規(guī)律

由圖2可知，隨著純水浸種時間的延長，威氏綠絨蒿種子吸水速度先快后慢，呈現(xiàn)出3個階段，在0～2 h為急劇吸水階段，吸水率從0上升到36.7%，平均每小時吸水速率為18.35%。在2～12 h為緩慢吸水階段，吸水率從36.7%上升到最大值70.07%，平均吸水速率為3.34%。12～24 h為飽和吸水階段，吸水率維持動態(tài)恒定。

圖2 威氏綠絨蒿種子吸水率隨吸水時間變化規(guī)律

2.3 威氏綠絨蒿種子生理特性

經(jīng)測定，未經(jīng)激素處理的威氏綠絨蒿種子中丙二醛含量為(5.10±0.81)mmol·g-1；可溶性蛋白含量為(46.37±0.67)mg·g-1；超氧化物歧化酶活性為(559.33±17.80)U·g-1；過氧化物酶活性為(83.33±22.68)U·g-1；過氧化氫酶含量為(2 777.78±444.88)U·g-1。

2.4 不同濃度GA3對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

由圖3可知，100 mg·L-1、200 mg·L-1、800 mg·L-1GA3處理均能提高威氏綠絨蒿種子的發(fā)芽率，當(dāng)GA3濃度為800 mg·L-1時促進(jìn)種子萌發(fā)的效果最顯著(p<0.05)。當(dāng)GA3濃度在200～800 mg·L-1之間時均能顯著提高種子的發(fā)芽勢(p<0.01)，400 mg·L-1和800 mg·L-1GA3濃度處理過的威氏綠絨蒿種子平均發(fā)芽時間和發(fā)芽啟動時間均顯著縮短(p<0.05)，800 mg·L-1GA3處理顯著提高了種子發(fā)芽指數(shù)(p<0.05)?？傮w來看，GA3處理能夠促進(jìn)種子萌發(fā)，800 mg·L-1GA3促進(jìn)效果最顯著(p<0.05)，相較于ck發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別增加了23.89%、12.56%和2.03，但平均發(fā)芽時間縮短了8.43 d，發(fā)芽啟動時間提前了5 d。

圖3 不同濃度GA3對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.5 不同濃度NAA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

由圖4可知，20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1NAA在一定程度上提高了種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，80 mg·L-1NAA顯著提高了種子的發(fā)芽指數(shù)(p<0.05)，而3 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1NAA處理則降低了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢。各濃度NAA處理對種子平均發(fā)芽時間影響均不顯著(p>0.05)，40 mg·L-1、80 mg·L-1NAA處理縮短了種子的發(fā)芽啟動時間?？傮w來看，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的各濃度NAA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，但都沒有達(dá)到顯著性差異水平(p>0.05)，80 mg·L-1NAA處理更有利于種子萌發(fā)。

圖4 不同濃度NAA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.6 不同濃度6-BA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

由圖5可知，經(jīng)低濃度6-BA處理后的威氏綠絨蒿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢較ck變化不大(p>0.05)，當(dāng)6-BA濃度超過10 mg·L-1時，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢隨激素濃度的增加而降低(p<0.05)；在發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時間以及發(fā)芽啟動時間上，各濃度6-BA處理的種子相對于ck無顯著性差異(p>0.05)。總體來看，低濃度6-BA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)影響不明顯，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到20 mg·L-1時，開始抑制威氏綠絨蒿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，使發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別降低67.12%和6.12%，當(dāng)6-BA 濃度為40 mg·L-1時對種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢抑制更明顯，分別降低了69.37%和14.7%。

圖5 不同濃度6-BA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.7 不同濃度SA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

由圖6可知，當(dāng)SA處理濃度在25～400 mg·L-1之間時，除發(fā)芽指數(shù)外其他各項(xiàng)測定指標(biāo)均與ck無顯著性差異(p>0.05)，當(dāng)SA濃度為800 mg·L-1時不僅降低了種子的發(fā)芽率，并且延長了種子的平均發(fā)芽時間和發(fā)芽啟動時間?？傮w來看，低濃度SA處理對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響不明顯，而高濃度的SA處理則抑制了威氏綠絨蒿種子的萌發(fā)，800 mg·L-1濃度的SA處理種子時，對種子萌發(fā)產(chǎn)生了明顯的抑制。

圖6 不同濃度SA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的影響

2.8 各激素處理促進(jìn)種子萌發(fā)效果綜合比較

由圖7可知，選取對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)促進(jìn)效果最好的激素濃度，綜合比較各激素對種子萌發(fā)促進(jìn)效果的差異。在發(fā)芽率的促進(jìn)效果上，800 mg·L-1GA3>80 mg·L-1NAA>25 mg·L-1SA>1 mg·L-16-BA；在發(fā)芽勢的促進(jìn)效果上，800 mg·L-1GA3>80 mg·L-1NAA，25 mg·L-1SA和1 mg·L-16-BA降低了發(fā)芽勢；在縮短平均發(fā)芽天數(shù)上，800 mg·L-1GA3>1 mg·L-16-BA>80 mg·L-1NAA>25 mg·L-1SA；在縮短發(fā)芽啟動時間上，800 mg·L-1GA3>1 mg·L-16-BA>80 mg·L-1NAA，25 mg·L-1SA增加的發(fā)芽啟動時間；在提升發(fā)芽指數(shù)上，800 mg·L-1GA3>80 mg·L-1NAA>1 mg·L-16-BA>25 mg·L-1SA。

圖7 各激素處理促進(jìn)種子萌發(fā)效果綜合比較

3 討 論

種子作為重要的繁殖器官，在植物適應(yīng)環(huán)境及繁殖過程中都具有重要作用。種子的形態(tài)特征具有相對穩(wěn)定性，種子微形態(tài)結(jié)構(gòu)與種子水分的吸收、種子的生活力以及種子的傳播、壽命、萌發(fā)速度的快慢和萌發(fā)率有著密切的聯(lián)系，種子的形態(tài)和質(zhì)量還能影響種子的散布距離[2]。袁長春[7]利用掃描電鏡對32種綠絨蒿種子進(jìn)行觀察研究，根據(jù)外種皮表面的紋飾和附屬物的差異，將綠絨蒿植物的種皮紋飾分為條紋型、網(wǎng)紋型、褶皺型和泡狀型。綜合體視鏡和掃面電鏡的觀察，威氏綠絨蒿種子近腎形，在低倍放大時，外種皮表面具有較密集的褶皺，且部分褶皺呈片塊狀，在高倍放大后，片塊狀褶皺呈雜亂狀的擠在一起，并有部分細(xì)絲狀物交織在一起，屬于褶皺型種子。

種子從收獲到播種都需要經(jīng)過一段時間的儲藏，隨著儲藏時間的增加，種子會逐漸失去活力，發(fā)芽率明顯下降，甚至難以萌發(fā)。在播種之前測定種子的生理生化反應(yīng)能更準(zhǔn)確地反應(yīng)出種子的活力和內(nèi)在品質(zhì)，也能更好的對儲藏中的種子是否能順利萌發(fā)做一個預(yù)判。目前關(guān)于種子活力的測定方法常用的有3種：第一是進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)；第二是測定生理生化指標(biāo)；第三是復(fù)合逆境法測定[8]。本實(shí)驗(yàn)通過測定種子的部分生理生化指標(biāo)以及進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，證明威氏綠絨蒿種子在進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)前是處于正常狀態(tài)且具有活力的種子。

種子休眠是指具有生活力的種子在適宜的萌發(fā)條件下仍不能萌發(fā)的現(xiàn)象, 大多數(shù)植物種子有或強(qiáng)或弱的休眠特性[9]。綠絨蒿生長于海拔2 500～5 500 m的高山上，高山上氣候多變，休眠可以防止種子在不適于自身生長的外界環(huán)境條件下萌發(fā)，種子休眠可能是綠絨蒿的一種生存策略[10]。不管這種策略是否存在，種子休眠都給綠絨蒿的科研栽培和生產(chǎn)栽培上帶來諸多不便，因此，科研和生產(chǎn)上都迫切需求找到破除綠絨蒿種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)的有效措施。

周健[11]研究表明，種子休眠可能是由于植物角質(zhì)層和柵欄層的結(jié)構(gòu)影響種子種皮透性所引起的。賴小連等[12]研究認(rèn)為，夏臘梅萌發(fā)困難是由于種皮堅硬，透水性較弱而導(dǎo)致。本研究表明，威氏綠絨蒿種子吸水速度先快后慢，浸種12 h種子吸水達(dá)到飽和并趨于穩(wěn)定，飽和時吸水率為67.65%，說明威氏綠絨蒿種子在萌發(fā)時不存在吸水障礙。另外，威氏綠絨蒿種子經(jīng)純水浸泡12 h后吸水率趨于飽和，這可為以后研究激素及其他物質(zhì)溶液對威氏綠絨蒿種子作用效果時種子浸泡處理時間的確定提供參考。

外源激素能夠?qū)χ参锓N子萌發(fā)起到促進(jìn)或抑制的作用[13]，常見的外源激素有GA3、NAA、6-BA、SA等。

GA3可促進(jìn)糊粉層細(xì)胞合成淀粉酶，淀粉酶能夠促進(jìn)胚乳中淀粉的水解，為胚的生長發(fā)育提供物質(zhì)和能量，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)[14]。200～300 mg·L-1GA3處理可提高長果綠絨蒿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，縮短平均發(fā)芽時間[15]，當(dāng)使用200 mg·L-1的GA3處理頂果木種子時，可顯著提高其發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，但濃度提升至300 mg·L-1時對種子萌發(fā)的促進(jìn)效果不如200 mg·L-1的處理好[16]。本實(shí)驗(yàn)表明，低濃度GA3對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)影響不顯著(p>0.05)，但當(dāng)GA3濃度達(dá)到800 mg·L-1時，可以極顯著地提高種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，降低平均發(fā)芽時間和發(fā)芽啟動時間(p<0.05)。但屈燕等[17]研究表明，100 mg·L-1GA3對總狀綠絨蒿種子萌發(fā)促進(jìn)最顯著。因此可以推斷，不同種類的綠絨蒿對不同外源激素處理的最適濃度不同。

NAA是一種廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑, 能夠促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和擴(kuò)大, 誘導(dǎo)不定根的形成[18]。研究表明，一定濃度的NAA預(yù)處理能夠提高植物種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢[19-21]，也有研究表明，NAA可抑制植物種子萌發(fā)[22]。本實(shí)驗(yàn)表明，NAA對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)影響不顯著，80 mg·L-1NAA雖可提高種子的萌發(fā)，但未能達(dá)到顯著性差異水平(p>0.05)，這可能是由于促進(jìn)威氏綠絨蒿種子萌發(fā)的NAA濃度高于80 mg·L-1。

6-BA是一種非植物內(nèi)源的生長調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)細(xì)胞的分裂，濃度適宜時可促進(jìn)種子的萌發(fā)，如0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-16-BA均能促進(jìn)花葉莧菜種子萌發(fā)，但6-BA 濃度為2 mg·L-1時則對種子萌發(fā)產(chǎn)生了抑制[23]。對于威氏綠絨蒿來說，1 mg·L-1、2 mg·L-1、5 mg·L-1和10 mg·L-16-BA處理的種子在發(fā)芽率和發(fā)芽勢上相對于ck均無顯著性差異(p>0.05)，但濃度大于20 mg·L-1時反而會降低種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，因此6-BA可能對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)無促進(jìn)作用，相反，20 mg·L-1以上濃度還會抑制種子萌發(fā)。

SA是植物界普遍存在的酚類化合物，對植物有積極的生理效應(yīng), 被認(rèn)為是一種新的植物內(nèi)源激素[24]。達(dá)清璟等[25]研究表明，不同濃度的SA處理能夠?qū)偁罹G絨蒿種子萌發(fā)產(chǎn)生不同程度的促進(jìn)和抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)SA濃度小于800 mg·L-1時對威氏綠絨蒿種子萌發(fā)影響不明顯(p>0.05)，當(dāng)濃度提升至800 mg·L-1時，SA不僅極顯著地降低了種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(p<0.01)，還增加了平均發(fā)芽時間和發(fā)芽啟動時間(p<0.01)，這說明總狀綠絨蒿與威氏綠絨蒿種子萌發(fā)特性并不相同。

4 結(jié) 論

威氏綠絨蒿種子近腎形，屬褶皺型種子。種子的休眠并不來源于吸水障礙，經(jīng)過不同濃度GA3、NAA、6-BA、SA處理后，發(fā)芽率最高的是GA3處理組，當(dāng)GA3濃度達(dá)到800 mg·L-1時，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢最高，平均發(fā)芽時間和發(fā)芽啟動時間最短。因此，為提升種子萌發(fā)效率，在播種威氏綠絨蒿時，建議預(yù)先采用800 mg·L-1GA3浸種24 h處理，6-BA和SA不適宜作為威氏綠絨蒿播種時的外源添加激素。