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        基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)溫陽解郁顆粒治療抑郁癥的作用機(jī)制研究

        2021-11-04 09:06:00馮振宇馬小娟趙建平
        關(guān)鍵詞:分析

        史 敏,馮振宇,孟 霜,馬小娟,趙建平

        (1.山西中醫(yī)藥大學(xué),山西 太原 030619;2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,山西 太原 030013)

        抑郁癥(depression)是一種常見的大腦功能紊亂性疾病,患者多表現(xiàn)為自主活動興趣持續(xù)性低落且思維緩慢、呆滯等,嚴(yán)重影響其自主生活能力和身心健康[1]。

        中醫(yī)對抑郁癥的研究最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“郁”的概念,中醫(yī)相關(guān)研究認(rèn)為情志內(nèi)傷是誘發(fā)郁證的主因素,體內(nèi)陽氣不能支撐生理功能正常運(yùn)行,神失所養(yǎng),再加上外界因素的刺激,長期耗傷機(jī)體氣血津液導(dǎo)致本虛,故抑郁癥常表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜,長期反復(fù)發(fā)作[2,3]。目前臨床上將藥物治療作為抗抑郁治療的關(guān)鍵且大多數(shù)以化學(xué)藥物為主,通過阻斷單一靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁作用,但絕大部分作用緩慢,易產(chǎn)生不良反應(yīng),長期服用還會出現(xiàn)明顯耐藥性[4]。中醫(yī)藥治療抑郁癥則從整體調(diào)節(jié)出發(fā),利用中藥組分多途徑、多靶點(diǎn)、多層次的作用特點(diǎn),對患者進(jìn)行辯證個(gè)體化治療。近年隨著國內(nèi)外學(xué)者不斷深入研究,中藥單方及復(fù)方在治療不同類型抑郁癥方面的臨床療效顯著。

        從中醫(yī)角度來看,抑郁癥大多以肝氣郁結(jié)為基礎(chǔ)病機(jī),多為機(jī)體陽氣不足,神失所養(yǎng)而致[5]。溫陽解郁顆粒是由鄭欽安《醫(yī)法圓通》之補(bǔ)坎益離丹化裁而來,由桂枝、附子、炙甘草、烏梅、大棗、生姜六味藥組成,有復(fù)腎陽、補(bǔ)肝陽、暖心陽、運(yùn)脾陽之功效,能收納微陽于腎,伏虛火于中,緩解因長期生活壓力、精神緊張導(dǎo)致的腎精受損、陽氣不足,在臨床抗抑郁治療中取得良好成果[6]。

        課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溫陽解郁顆粒能顯著改善慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激模型(CMUS)大鼠的抑郁行為,并通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證溫陽解郁顆粒可調(diào)控CUMS 大 鼠HPA 軸 功 能,改 善 抑 郁 樣 行 為[7,8]。但它如何緩減海馬組織形態(tài)改變以及其具體分子作用機(jī)制尚未明確,需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。因此,本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法建立“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,探討溫陽解郁顆粒治療抑郁癥的分子作用機(jī)制,并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選的抗抑郁主靶點(diǎn),為深入研究其抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn)、通路及臨床運(yùn)用研究提供一定數(shù)據(jù)參考。

        1 資料與方法

        1.1 溫陽解郁顆?;瘜W(xué)成分的收集

        利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP[9](http://tcmspw.com/tcmsp.php)、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)分 別 以“附 子”、“甘 草”、“桂 枝”、“烏 梅”、“生 姜”、“大棗”為關(guān)鍵詞檢索溫陽解郁顆粒組方的化學(xué)成分,并通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取這些化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu),保存為Canonical SMILES 格式。

        1.2 活性化學(xué)成分的篩選及潛在作用靶點(diǎn)篩選

        新藥研發(fā)領(lǐng)域,類藥五原則常被用于新藥合成的初篩,符合此規(guī)則的化合物有更好的藥代動力學(xué)性質(zhì),更利于機(jī)體代謝吸收,成為口服藥物的可能性更大。最常見的藥物篩選藥代動力學(xué)參數(shù)有生物利用度(OB)和類藥性(DL),由于抗抑郁藥物需穿越血腦屏障到達(dá)大腦相關(guān)區(qū)域,改善抑郁癥狀,還應(yīng)考慮血腦屏障值,故以O(shè)B≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3 以及類藥五原則為篩選條件,確定溫陽解郁顆粒的有效活性成分[10-12]。利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫,輸入有效活性成分Canonical SMILES 格式,設(shè)置“人類”為研究物種,得到它們的作用靶點(diǎn),整理去重后得到溫陽解郁顆粒的潛在作用靶點(diǎn)。

        1.3 疾病靶點(diǎn)篩選

        借助OMIM(http://www.omim.org/)、Gene-Cards、(https://www.genecards.org/)TCMSP 數(shù)據(jù)庫,以“Depression”為關(guān)鍵詞檢索,并以Relevance score 為參考值,篩選確定抑郁癥的相關(guān)基因。

        1.4 溫陽解郁顆??挂钟粲行Щ钚曰衔锱c關(guān)鍵靶點(diǎn)相映射,構(gòu)建核心靶蛋白作用網(wǎng)絡(luò)

        借 助Cytoscape 軟 件(Version 3.6.1,http://www. cytoscape.org)繪 制“抑 郁 癥-溫 陽 解 郁 顆粒-有效活性化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。分別以藥物、疾病、有效活性化合物、潛在作用靶點(diǎn)為Node(節(jié)點(diǎn)),四者之間的相互關(guān)系為edge(邊),利用“Network Analysis”功能并依據(jù)節(jié)點(diǎn)度值(Degree)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治?,提取溫陽解郁顆粒抗抑郁的核心作用網(wǎng)絡(luò),同時(shí)選擇節(jié)點(diǎn)自由度值≥平均自由度的靶 點(diǎn) 蛋 白,導(dǎo) 入String 數(shù) 據(jù) 庫(https://string-db.org/cgi/input.pL),設(shè)置物種為人類、置信度為mediumconfidence=0.4,獲取蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

        1.5 GO 富集分析和KEGG 通路分析

        將得到的溫陽解郁顆粒的潛在抗抑郁作用靶點(diǎn)導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫[13](DAVID,https://david.ncifcrf.gov/),物種限定“人類”,對靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物過程(Gene Ontology-biological process)富集分析和KEGG Pathway 富集分析,保存結(jié)果,以P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選其抗抑郁生物過程及信號通路,分析溫陽解郁顆??赡艿闹委熞钟舭Y的分子作用機(jī)制。

        1.6 分子對接

        取拓?fù)浞治鰰r(shí)度值較高的溫陽解郁顆粒核心活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)利用AutoDock Vina_1.1.2 進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其相互作用活性。具體實(shí)驗(yàn)方法:(1)登錄TCMSP 網(wǎng)頁下載保存核心活性成分3D 結(jié)構(gòu)式,存為“mol 2”格式,利用AutoDock Tools將分子結(jié)構(gòu)分別加氫原子、平衡電荷、能量最小化最后存為PDBQT 格式。(2)在PDB 網(wǎng)頁下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu),存為“pdb”格式,利用AutoDock Tools 分離其配體、去水、加氫、計(jì)算電荷后同樣存為PDBQT 格式。(3)調(diào)整對接盒子的大小和格點(diǎn)中心,進(jìn)行分子對接,并對對接結(jié)果進(jìn)行分析。(4)利用PyMOL 軟件進(jìn)行圖像化展示。

        2 結(jié)果

        2.1 溫陽解郁顆粒有效活性成分

        通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫分別檢索溫陽解郁顆粒中6 味中藥的化合物,得到附子65個(gè)、甘草280 個(gè)、桂枝220 個(gè)、烏梅40 個(gè)、生姜265 個(gè)和大棗133 個(gè),通過“類藥五原則”及OB≥30%、DL≥0.18 和BBB≥-0.3 的篩選條件,但考慮到在藥物活性成分篩選時(shí),有一些成分因藥代動力學(xué)參數(shù)較差而被篩除,但其中有些屬于藥物的主要成分,含量占比豐富,例如桂皮醛、菖蒲烯、香豆精在桂枝中含量較高[14],次烏頭堿、甘草苷等也同樣是附子、甘草的主要成分且文獻(xiàn)研究廣泛,故將它們均添加為溫陽解郁顆粒的有效活性成分一起做潛在靶點(diǎn)分析。結(jié)果得到溫陽解郁顆粒的潛在活性成分:附子8 個(gè)、甘草50 個(gè)、桂枝7 個(gè)、烏梅5 個(gè)、生姜4 個(gè),大棗18 個(gè)。

        2.2 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

        通過GeneCard、OMMI 數(shù)據(jù)庫得到抑郁癥相關(guān)基因靶點(diǎn)11 449 個(gè),通過利用“Relevance score≥10”的條件篩選,最終得到513 個(gè)疾病靶點(diǎn)。利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫得到潛在預(yù)測靶點(diǎn)的結(jié)果為:附子362 個(gè)、桂枝128 個(gè)、烏梅151 個(gè)、甘草594 個(gè)、大棗513 個(gè)、生姜139 個(gè)。將它們?nèi)ブ睾笈c疾病靶點(diǎn)相映射,繪制韋恩圖(圖1),并得到溫陽解郁顆粒治療抑郁癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因118 個(gè)。同時(shí)將附子、甘草、桂枝、大棗、烏梅、生姜六味藥的抗抑郁靶點(diǎn)相映射,得到共同抗抑郁基因6 個(gè)(圖2),進(jìn)一步說明溫陽解郁顆粒通過各藥味協(xié)同作用,多靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁功效。

        圖1 溫陽解郁顆粒與抑郁癥靶點(diǎn)相映射韋恩圖Fig 1 Venn map of Wenyang Jieyu Granule and depression target

        圖2 附子、甘草、烏梅、桂枝、大棗、生姜抗抑郁靶點(diǎn)相映射韋恩圖Fig 2 Venn map of anti-depressant target of aconite,liquorice,dark plum,cassia twig,jujube and ginger

        2.3 構(gòu)建“溫陽解郁顆粒-有效活性化合物-靶點(diǎn)-抑郁癥”網(wǎng)絡(luò)

        將藥物活性成分、潛在作用靶點(diǎn)、疾病分別導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,得到“溫陽解郁顆粒有效活性化合物-潛在抗抑郁作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),同時(shí)用Cytohubbe 插件將節(jié)點(diǎn)按自由度值拓?fù)浞治?,提取溫陽解郁顆粒抗抑郁的核心作用網(wǎng)絡(luò)(圖3),同時(shí)映射得到40 個(gè)核心靶點(diǎn)及47 個(gè)核心成分,部分相關(guān)信息見表1。圖3 中三角形代表溫陽解郁顆??挂钟艉诵挠行Щ钚曰衔?,橢圓形節(jié)點(diǎn)則代表溫陽解郁顆粒潛在關(guān)鍵抗抑郁靶點(diǎn),各節(jié)點(diǎn)間連線緊密復(fù)雜,進(jìn)一步體現(xiàn)溫陽解郁顆粒多靶點(diǎn)、多組分的抗抑郁治療優(yōu)勢,度值由大到小則用顏色深淺來體現(xiàn),顏色越深表示該節(jié)點(diǎn)在溫陽解郁顆粒抗抑郁機(jī)制中越重要,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證選取靶點(diǎn)或成分提供依據(jù)。

        表1 部分溫陽解郁顆??挂钟舻暮诵幕钚猿煞旨坝成浜Y選的靶點(diǎn)信息Tab 1 Core active components and mapping screening for antidepressant of Wenyang Jieyu Granule

        圖3 “溫陽解郁顆粒抗抑郁核心成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Visual network of antidepressant core components and targets of Wenyang Jieyu Granule

        將2.2 中得到的溫陽解郁顆粒40 個(gè)核心抗抑郁靶點(diǎn)基因輸入String 軟件中進(jìn)行分析,剔除游離蛋白,設(shè)置物種為人類,置信度為mediumconfidence=0.4,得到蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(圖4)。其節(jié)點(diǎn)代表抗抑郁基因蛋白,每條邊則表示不同蛋白間相互作用關(guān)系,線條越粗則關(guān)聯(lián)度越大。

        圖4 核心蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI 圖)Fig 4 Core protein interaction network diagram(PPI)

        2.4 GO 生物學(xué)過程富集分析

        進(jìn)一步闡明核心靶點(diǎn)相互作用關(guān)系,利用DAVID 數(shù)據(jù)庫GO 功能富集分析,得到GO 條目165 個(gè)(P<0.05),選取生物學(xué)功能前30 個(gè)條目分析主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體傳導(dǎo)、銨離子結(jié)合、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活動、G 蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活動等過程,見圖5。

        圖5 GO 生物學(xué)功能富集分析Fig 5 GO biological function enrichment analysis

        2.5 KEGG 通路富集分析結(jié)果

        KEGG 通路富集分析得到131 條信號通路(P<0.05),依據(jù)count 值篩選出較前30 個(gè)條目,主要涉及Neuroactive ligand-receptor interaction(神經(jīng)活動配體-受體相互作用信號通路,44 個(gè)基因)、cAMP signaling pathway(cAMP 信號通路,24 個(gè)基因)、Serotonergic synapse(含血清素的神經(jīng)突觸調(diào)節(jié)信號通路,23 個(gè)基因)、Calcium signaling pathway(鈣信號通路,19 個(gè)基因)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt 信號通路、16 個(gè)基因)、MAPK signaling pathway(MAPA 信號通路,含13 個(gè)基因)、ErbB signaling pathway(ErbB 通路,12 個(gè)基因)等,見圖6。課題組前期通過曠場實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及夾尾實(shí)驗(yàn),證明溫陽解郁顆??梢燥@著改善抑郁大鼠自主活動能力及抑郁樣行為。相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示灌胃溫陽解郁顆粒后,溫陽解郁顆粒組大鼠血清內(nèi)的5-HT、DA 含 量 較 模 型 組 均 有 明 顯 提 高[22],而CORT、ACHE 水 平 有 顯 著 下 調(diào)[7,8]。課 題 組 通 過PT-PCR 等試驗(yàn),證明溫陽解郁顆??梢韵抡{(diào)抑郁大鼠CRH 表達(dá),恢復(fù)GR 水平減輕抑郁癥狀,有效調(diào)節(jié)保護(hù)海馬組織,影響HPA 軸功能并相應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)激素水平。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG 通路分析來看溫陽解郁顆粒可以通過有效調(diào)節(jié)5-HT 等激素水平,刺激并介導(dǎo)Serotonergic synapse 通路(圖7)傳導(dǎo),提高Gc 等受體蛋白表達(dá),減緩高水平糖皮質(zhì)激素對大腦損傷。同時(shí)還可看出某些靶點(diǎn)基因在信號傳導(dǎo)過程中刺激激活cAMP、PKA、P13K-Akt、MAPK 等其他信號通路,表明溫陽解郁顆粒的多種活性成分通過參與多條信號通路,協(xié)同發(fā)揮抗抑郁療效。

        圖6 KEGG 通路富集分析Fig 6 KEGG path enrichment analysis

        圖7 溫陽解郁顆??挂钟鬝erotonergic synapse 通路相關(guān)靶點(diǎn)Fig 7 Related targets of serotonergic synapse anti-depressive pathway in Wenyang Jieyu Granule

        2.6 分子對接結(jié)果

        由“溫陽解郁顆??挂钟艉诵幕钚猿煞?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果可知,溫陽解郁顆??挂钟魸撛诨?性 成 分 中,beta-sitosterol、Nuciferin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone3 個(gè)成分,度值>27,同時(shí)ESR1、ACHE、SLC6A2、MAOA 靶點(diǎn)度值連接數(shù)排列靠前。將它們分別進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn),并對對接結(jié)果(圖8)進(jìn)行分析打分,結(jié)果見表2。從表中可以看出Affinity 得分在“-3.25~-10.65”之間,表明beta-sitosterol 等活性成分與ESR1 等關(guān)鍵靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合力。

        圖8 貼合口袋結(jié)果(每一列依次是beta-sitosterol,Nuciferin,7-Methoxy-2-methyl isoflavone,每一行依次是ESR1,ACHE,SLC6A2,MAOA)Fig 8 Bagging results(beta-sitosterol,Nuciferin,7-Methoxy-2-methyl isoflavone for each column in turn;ESR1,ACHE,SLC6A2,MAOA for each row in turn)

        表2 分子對接結(jié)果Tab 2 Molecular docking results

        3 討論

        從“溫陽解郁顆??挂钟艉诵幕衔?靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖可以看出溫陽解郁顆粒47 個(gè)核心活性成分作用于40 個(gè)抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn),相互作用關(guān)系復(fù)雜,體現(xiàn)中藥復(fù)方多組分、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)。據(jù)拓?fù)浞治隹芍?谷甾醇、豆甾醇、二氫辣椒堿、甘草酚等成分在溫陽解郁顆??挂钟舣熜е锌赡苡兄匾饔?,但文獻(xiàn)檢索結(jié)果卻鮮有數(shù)據(jù)說明它們與治療抑郁癥有關(guān)。而從靶點(diǎn)角度來看,ACHE、ESR1、SLC6A2、MAOAB 度值連接次數(shù)均在26 次以上,推測它們是抗抑郁治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。同時(shí)借助分子對接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)有良好的結(jié)合力,同時(shí)文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果作為輔證證明,柴胡疏肝散[15]、β-細(xì)辛醚[16]等可通過抑制ACHE 活性以及通過其可激活nAChRs 介導(dǎo)的多巴胺信號通路,調(diào)節(jié)相關(guān)激素水平,發(fā)揮抗抑郁療效。而ESR1與ER-α 受體結(jié)合后可參與腦組織神經(jīng)遞質(zhì)傳遞,影響神經(jīng)營養(yǎng)因子及HPA 軸水平,治療抑郁癥相關(guān)癥狀[17]。而SLC6A2、MAOA、ABCB1 基因多態(tài)性常被用來與不同類型的抗抑郁藥物療效比較相關(guān)性[18-21]。因此,可推測溫陽解郁顆粒通過多種成分協(xié)同發(fā)揮抗抑郁作用,其關(guān)鍵機(jī)制可結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得到的溫陽解郁顆??挂钟舭悬c(diǎn)、核心成分等數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步探索研究。

        從GO 富集及KEGG 通路富集分析結(jié)果來看溫陽解郁顆粒發(fā)揮抗抑郁療效主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體傳導(dǎo)、銨離子結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活動等生物過程,參與調(diào)控含血清素的神經(jīng)突觸調(diào)節(jié)、cAMP、PI3K-Akt、MAPA、ErbBs 等131 條 信 號 通路。結(jié)合本文KEGG 富集結(jié)果中cAMP、Serotonergic synapse 通路分析圖可驗(yàn)證動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果,增加對溫陽解郁顆??挂钟糇饔脵C(jī)制推測的準(zhǔn)確性,同時(shí)表明溫陽解郁顆粒多靶點(diǎn)、多條通路交互協(xié)同作用的特點(diǎn),為今后溫陽解郁顆粒藥效基礎(chǔ)及抗抑郁作用機(jī)制深入研究提供方向,比如從5-HT、DA 等神經(jīng)遞質(zhì)代謝出發(fā)探究溫陽解郁顆??挂钟絷P(guān)鍵作用靶點(diǎn);從體外培養(yǎng)細(xì)胞層次上具體研究分析溫陽解郁對海馬神經(jīng)細(xì)胞功能的具體調(diào)控作用;分析溫陽解郁顆粒多條抗抑郁通路的相互作用等。

        綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對溫陽解郁顆粒的藥味化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和其抗抑郁通路作用分析進(jìn)行了探索性研究,從中可以看出溫陽解郁顆??挂钟糁委煹奶攸c(diǎn)為多組分、多靶點(diǎn)、通路交互、協(xié)同作用。但在某些方面存在一定局限,比如利用藥代動力學(xué)參數(shù)篩選活性成分時(shí),某些藥物主成分會被剔除,反映出溫陽解郁顆粒復(fù)方中其他藥味也可能存在有效活性成分未被發(fā)掘的情況,故后期研究應(yīng)不斷深入與補(bǔ)充,并對現(xiàn)發(fā)掘的藥物成分進(jìn)行具體的藥效基礎(chǔ)研究,增加科學(xué)研究的可行性、準(zhǔn)確度,為后期課題組對溫陽解郁顆粒藥味物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制通路驗(yàn)證等具體實(shí)驗(yàn)研究提供方向與參考,為中藥抗抑郁研究提供思路。

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