史 敏，馮振宇，孟 霜，馬小娟，趙建平

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030619；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西 太原 030013）

抑郁癥（depression）是一種常見的大腦功能紊亂性疾病，患者多表現(xiàn)為自主活動興趣持續(xù)性低落且思維緩慢、呆滯等，嚴(yán)重影響其自主生活能力和身心健康［1］。

中醫(yī)對抑郁癥的研究最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“郁”的概念，中醫(yī)相關(guān)研究認(rèn)為情志內(nèi)傷是誘發(fā)郁證的主因素，體內(nèi)陽氣不能支撐生理功能正常運(yùn)行，神失所養(yǎng)，再加上外界因素的刺激，長期耗傷機(jī)體氣血津液導(dǎo)致本虛，故抑郁癥常表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜，長期反復(fù)發(fā)作［2，3］。目前臨床上將藥物治療作為抗抑郁治療的關(guān)鍵且大多數(shù)以化學(xué)藥物為主，通過阻斷單一靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁作用，但絕大部分作用緩慢，易產(chǎn)生不良反應(yīng)，長期服用還會出現(xiàn)明顯耐藥性［4］。中醫(yī)藥治療抑郁癥則從整體調(diào)節(jié)出發(fā)，利用中藥組分多途徑、多靶點(diǎn)、多層次的作用特點(diǎn)，對患者進(jìn)行辯證個(gè)體化治療。近年隨著國內(nèi)外學(xué)者不斷深入研究，中藥單方及復(fù)方在治療不同類型抑郁癥方面的臨床療效顯著。

從中醫(yī)角度來看，抑郁癥大多以肝氣郁結(jié)為基礎(chǔ)病機(jī)，多為機(jī)體陽氣不足，神失所養(yǎng)而致［5］。溫陽解郁顆粒是由鄭欽安《醫(yī)法圓通》之補(bǔ)坎益離丹化裁而來，由桂枝、附子、炙甘草、烏梅、大棗、生姜六味藥組成，有復(fù)腎陽、補(bǔ)肝陽、暖心陽、運(yùn)脾陽之功效，能收納微陽于腎，伏虛火于中，緩解因長期生活壓力、精神緊張導(dǎo)致的腎精受損、陽氣不足，在臨床抗抑郁治療中取得良好成果［6］。

課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溫陽解郁顆粒能顯著改善慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激模型（CMUS）大鼠的抑郁行為，并通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證溫陽解郁顆粒可調(diào)控CUMS 大 鼠HPA 軸 功 能，改 善 抑 郁 樣 行 為［7，8］。但它如何緩減海馬組織形態(tài)改變以及其具體分子作用機(jī)制尚未明確，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。因此，本文擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法建立“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，探討溫陽解郁顆粒治療抑郁癥的分子作用機(jī)制，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選的抗抑郁主靶點(diǎn)，為深入研究其抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn)、通路及臨床運(yùn)用研究提供一定數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 溫陽解郁顆?；瘜W(xué)成分的收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP［9］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）分 別 以“附 子”、“甘 草”、“桂 枝”、“烏 梅”、“生 姜”、“大棗”為關(guān)鍵詞檢索溫陽解郁顆粒組方的化學(xué)成分，并通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取這些化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)，保存為Canonical SMILES 格式。

1.2 活性化學(xué)成分的篩選及潛在作用靶點(diǎn)篩選

新藥研發(fā)領(lǐng)域，類藥五原則常被用于新藥合成的初篩，符合此規(guī)則的化合物有更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)，更利于機(jī)體代謝吸收，成為口服藥物的可能性更大。最常見的藥物篩選藥代動力學(xué)參數(shù)有生物利用度（OB）和類藥性（DL），由于抗抑郁藥物需穿越血腦屏障到達(dá)大腦相關(guān)區(qū)域，改善抑郁癥狀，還應(yīng)考慮血腦屏障值，故以O(shè)B≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3 以及類藥五原則為篩選條件，確定溫陽解郁顆粒的有效活性成分［10-12］。利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，輸入有效活性成分Canonical SMILES 格式，設(shè)置“人類”為研究物種，得到它們的作用靶點(diǎn)，整理去重后得到溫陽解郁顆粒的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選

借助OMIM（http：//www.omim.org/）、Gene-Cards、（https：//www.genecards.org/）TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以“Depression”為關(guān)鍵詞檢索，并以Relevance score 為參考值，篩選確定抑郁癥的相關(guān)基因。

1.4 溫陽解郁顆?？挂钟粲行Щ钚曰衔锱c關(guān)鍵靶點(diǎn)相映射，構(gòu)建核心靶蛋白作用網(wǎng)絡(luò)

借 助Cytoscape 軟 件（Version 3.6.1，http：//www. cytoscape.org）繪 制“抑 郁 癥-溫 陽 解 郁 顆粒-有效活性化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。分別以藥物、疾病、有效活性化合物、潛在作用靶點(diǎn)為Node（節(jié)點(diǎn)），四者之間的相互關(guān)系為edge（邊），利用“Network Analysis”功能并依據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（Degree）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治?，提取溫陽解郁顆粒抗抑郁的核心作用網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)選擇節(jié)點(diǎn)自由度值≥平均自由度的靶 點(diǎn) 蛋 白，導(dǎo) 入String 數(shù) 據(jù) 庫（https：//string-db.org/cgi/input.pL），設(shè)置物種為人類、置信度為mediumconfidence=0.4，獲取蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO 富集分析和KEGG 通路分析

將得到的溫陽解郁顆粒的潛在抗抑郁作用靶點(diǎn)導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫［13］（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/），物種限定“人類”，對靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物過程（Gene Ontology-biological process）富集分析和KEGG Pathway 富集分析，保存結(jié)果，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選其抗抑郁生物過程及信號通路，分析溫陽解郁顆?？赡艿闹委熞钟舭Y的分子作用機(jī)制。

1.6 分子對接

取拓?fù)浞治鰰r(shí)度值較高的溫陽解郁顆粒核心活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)利用AutoDock Vina_1.1.2 進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其相互作用活性。具體實(shí)驗(yàn)方法：（1）登錄TCMSP 網(wǎng)頁下載保存核心活性成分3D 結(jié)構(gòu)式，存為“mol 2”格式，利用AutoDock Tools將分子結(jié)構(gòu)分別加氫原子、平衡電荷、能量最小化最后存為PDBQT 格式。（2）在PDB 網(wǎng)頁下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，存為“pdb”格式，利用AutoDock Tools 分離其配體、去水、加氫、計(jì)算電荷后同樣存為PDBQT 格式。（3）調(diào)整對接盒子的大小和格點(diǎn)中心，進(jìn)行分子對接，并對對接結(jié)果進(jìn)行分析。（4）利用PyMOL 軟件進(jìn)行圖像化展示。

2 結(jié)果

2.1 溫陽解郁顆粒有效活性成分

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫分別檢索溫陽解郁顆粒中6 味中藥的化合物，得到附子65個(gè)、甘草280 個(gè)、桂枝220 個(gè)、烏梅40 個(gè)、生姜265 個(gè)和大棗133 個(gè)，通過“類藥五原則”及OB≥30%、DL≥0.18 和BBB≥-0.3 的篩選條件，但考慮到在藥物活性成分篩選時(shí)，有一些成分因藥代動力學(xué)參數(shù)較差而被篩除，但其中有些屬于藥物的主要成分，含量占比豐富，例如桂皮醛、菖蒲烯、香豆精在桂枝中含量較高［14］，次烏頭堿、甘草苷等也同樣是附子、甘草的主要成分且文獻(xiàn)研究廣泛，故將它們均添加為溫陽解郁顆粒的有效活性成分一起做潛在靶點(diǎn)分析。結(jié)果得到溫陽解郁顆粒的潛在活性成分：附子8 個(gè)、甘草50 個(gè)、桂枝7 個(gè)、烏梅5 個(gè)、生姜4 個(gè)，大棗18 個(gè)。

2.2 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

通過GeneCard、OMMI 數(shù)據(jù)庫得到抑郁癥相關(guān)基因靶點(diǎn)11 449 個(gè)，通過利用“Relevance score≥10”的條件篩選，最終得到513 個(gè)疾病靶點(diǎn)。利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫得到潛在預(yù)測靶點(diǎn)的結(jié)果為：附子362 個(gè)、桂枝128 個(gè)、烏梅151 個(gè)、甘草594 個(gè)、大棗513 個(gè)、生姜139 個(gè)。將它們?nèi)ブ睾笈c疾病靶點(diǎn)相映射，繪制韋恩圖（圖1），并得到溫陽解郁顆粒治療抑郁癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因118 個(gè)。同時(shí)將附子、甘草、桂枝、大棗、烏梅、生姜六味藥的抗抑郁靶點(diǎn)相映射，得到共同抗抑郁基因6 個(gè)（圖2），進(jìn)一步說明溫陽解郁顆粒通過各藥味協(xié)同作用，多靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁功效。

圖1 溫陽解郁顆粒與抑郁癥靶點(diǎn)相映射韋恩圖Fig 1 Venn map of Wenyang Jieyu Granule and depression target

圖2 附子、甘草、烏梅、桂枝、大棗、生姜抗抑郁靶點(diǎn)相映射韋恩圖Fig 2 Venn map of anti-depressant target of aconite，liquorice，dark plum，cassia twig，jujube and ginger

2.3 構(gòu)建“溫陽解郁顆粒-有效活性化合物-靶點(diǎn)-抑郁癥”網(wǎng)絡(luò)

將藥物活性成分、潛在作用靶點(diǎn)、疾病分別導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到“溫陽解郁顆粒有效活性化合物-潛在抗抑郁作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)用Cytohubbe 插件將節(jié)點(diǎn)按自由度值拓?fù)浞治?，提取溫陽解郁顆粒抗抑郁的核心作用網(wǎng)絡(luò)（圖3），同時(shí)映射得到40 個(gè)核心靶點(diǎn)及47 個(gè)核心成分，部分相關(guān)信息見表1。圖3 中三角形代表溫陽解郁顆?？挂钟艉诵挠行Щ钚曰衔?，橢圓形節(jié)點(diǎn)則代表溫陽解郁顆粒潛在關(guān)鍵抗抑郁靶點(diǎn)，各節(jié)點(diǎn)間連線緊密復(fù)雜，進(jìn)一步體現(xiàn)溫陽解郁顆粒多靶點(diǎn)、多組分的抗抑郁治療優(yōu)勢，度值由大到小則用顏色深淺來體現(xiàn)，顏色越深表示該節(jié)點(diǎn)在溫陽解郁顆粒抗抑郁機(jī)制中越重要，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證選取靶點(diǎn)或成分提供依據(jù)。

表1 部分溫陽解郁顆?？挂钟舻暮诵幕钚猿煞旨坝成浜Y選的靶點(diǎn)信息Tab 1 Core active components and mapping screening for antidepressant of Wenyang Jieyu Granule

圖3 “溫陽解郁顆粒抗抑郁核心成分-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Visual network of antidepressant core components and targets of Wenyang Jieyu Granule

將2.2 中得到的溫陽解郁顆粒40 個(gè)核心抗抑郁靶點(diǎn)基因輸入String 軟件中進(jìn)行分析，剔除游離蛋白，設(shè)置物種為人類，置信度為mediumconfidence=0.4，得到蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖4）。其節(jié)點(diǎn)代表抗抑郁基因蛋白，每條邊則表示不同蛋白間相互作用關(guān)系，線條越粗則關(guān)聯(lián)度越大。

圖4 核心蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI 圖）Fig 4 Core protein interaction network diagram（PPI）

2.4 GO 生物學(xué)過程富集分析

進(jìn)一步闡明核心靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，利用DAVID 數(shù)據(jù)庫GO 功能富集分析，得到GO 條目165 個(gè)（P＜0.05），選取生物學(xué)功能前30 個(gè)條目分析主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體傳導(dǎo)、銨離子結(jié)合、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活動、G 蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活動等過程，見圖5。

圖5 GO 生物學(xué)功能富集分析Fig 5 GO biological function enrichment analysis

2.5 KEGG 通路富集分析結(jié)果

KEGG 通路富集分析得到131 條信號通路（P＜0.05），依據(jù)count 值篩選出較前30 個(gè)條目，主要涉及Neuroactive ligand-receptor interaction（神經(jīng)活動配體-受體相互作用信號通路，44 個(gè)基因）、cAMP signaling pathway（cAMP 信號通路，24 個(gè)基因）、Serotonergic synapse（含血清素的神經(jīng)突觸調(diào)節(jié)信號通路，23 個(gè)基因）、Calcium signaling pathway（鈣信號通路，19 個(gè)基因）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信號通路、16 個(gè)基因）、MAPK signaling pathway（MAPA 信號通路，含13 個(gè)基因）、ErbB signaling pathway（ErbB 通路，12 個(gè)基因）等，見圖6。課題組前期通過曠場實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及夾尾實(shí)驗(yàn)，證明溫陽解郁顆?？梢燥@著改善抑郁大鼠自主活動能力及抑郁樣行為。相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示灌胃溫陽解郁顆粒后，溫陽解郁顆粒組大鼠血清內(nèi)的5-HT、DA 含 量 較 模 型 組 均 有 明 顯 提 高［22］，而CORT、ACHE 水 平 有 顯 著 下 調(diào)［7，8］。課 題 組 通 過PT-PCR 等試驗(yàn)，證明溫陽解郁顆?？梢韵抡{(diào)抑郁大鼠CRH 表達(dá)，恢復(fù)GR 水平減輕抑郁癥狀，有效調(diào)節(jié)保護(hù)海馬組織，影響HPA 軸功能并相應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)激素水平。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG 通路分析來看溫陽解郁顆粒可以通過有效調(diào)節(jié)5-HT 等激素水平，刺激并介導(dǎo)Serotonergic synapse 通路（圖7）傳導(dǎo)，提高Gc 等受體蛋白表達(dá)，減緩高水平糖皮質(zhì)激素對大腦損傷。同時(shí)還可看出某些靶點(diǎn)基因在信號傳導(dǎo)過程中刺激激活cAMP、PKA、P13K-Akt、MAPK 等其他信號通路，表明溫陽解郁顆粒的多種活性成分通過參與多條信號通路，協(xié)同發(fā)揮抗抑郁療效。

圖6 KEGG 通路富集分析Fig 6 KEGG path enrichment analysis

圖7 溫陽解郁顆?？挂钟鬝erotonergic synapse 通路相關(guān)靶點(diǎn)Fig 7 Related targets of serotonergic synapse anti-depressive pathway in Wenyang Jieyu Granule

2.6 分子對接結(jié)果

由“溫陽解郁顆?？挂钟艉诵幕钚猿煞?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果可知，溫陽解郁顆?？挂钟魸撛诨?性 成 分 中，beta-sitosterol、Nuciferin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone3 個(gè)成分，度值＞27，同時(shí)ESR1、ACHE、SLC6A2、MAOA 靶點(diǎn)度值連接數(shù)排列靠前。將它們分別進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn)，并對對接結(jié)果（圖8）進(jìn)行分析打分，結(jié)果見表2。從表中可以看出Affinity 得分在“-3.25～-10.65”之間，表明beta-sitosterol 等活性成分與ESR1 等關(guān)鍵靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合力。

圖8 貼合口袋結(jié)果（每一列依次是beta-sitosterol，Nuciferin，7-Methoxy-2-methyl isoflavone，每一行依次是ESR1，ACHE，SLC6A2，MAOA）Fig 8 Bagging results（beta-sitosterol，Nuciferin，7-Methoxy-2-methyl isoflavone for each column in turn；ESR1，ACHE，SLC6A2，MAOA for each row in turn）

表2 分子對接結(jié)果Tab 2 Molecular docking results

3 討論

從“溫陽解郁顆?？挂钟艉诵幕衔?靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖可以看出溫陽解郁顆粒47 個(gè)核心活性成分作用于40 個(gè)抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn)，相互作用關(guān)系復(fù)雜，體現(xiàn)中藥復(fù)方多組分、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)。據(jù)拓?fù)浞治隹芍?谷甾醇、豆甾醇、二氫辣椒堿、甘草酚等成分在溫陽解郁顆?？挂钟舣熜е锌赡苡兄匾饔?，但文獻(xiàn)檢索結(jié)果卻鮮有數(shù)據(jù)說明它們與治療抑郁癥有關(guān)。而從靶點(diǎn)角度來看，ACHE、ESR1、SLC6A2、MAOAB 度值連接次數(shù)均在26 次以上，推測它們是抗抑郁治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。同時(shí)借助分子對接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)有良好的結(jié)合力，同時(shí)文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果作為輔證證明，柴胡疏肝散［15］、β-細(xì)辛醚［16］等可通過抑制ACHE 活性以及通過其可激活nAChRs 介導(dǎo)的多巴胺信號通路，調(diào)節(jié)相關(guān)激素水平，發(fā)揮抗抑郁療效。而ESR1與ER-α 受體結(jié)合后可參與腦組織神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，影響神經(jīng)營養(yǎng)因子及HPA 軸水平，治療抑郁癥相關(guān)癥狀［17］。而SLC6A2、MAOA、ABCB1 基因多態(tài)性常被用來與不同類型的抗抑郁藥物療效比較相關(guān)性［18-21］。因此，可推測溫陽解郁顆粒通過多種成分協(xié)同發(fā)揮抗抑郁作用，其關(guān)鍵機(jī)制可結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得到的溫陽解郁顆?？挂钟舭悬c(diǎn)、核心成分等數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步探索研究。

從GO 富集及KEGG 通路富集分析結(jié)果來看溫陽解郁顆粒發(fā)揮抗抑郁療效主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體傳導(dǎo)、銨離子結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活動等生物過程，參與調(diào)控含血清素的神經(jīng)突觸調(diào)節(jié)、cAMP、PI3K-Akt、MAPA、ErbBs 等131 條 信 號 通路。結(jié)合本文KEGG 富集結(jié)果中cAMP、Serotonergic synapse 通路分析圖可驗(yàn)證動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，增加對溫陽解郁顆?？挂钟糇饔脵C(jī)制推測的準(zhǔn)確性，同時(shí)表明溫陽解郁顆粒多靶點(diǎn)、多條通路交互協(xié)同作用的特點(diǎn)，為今后溫陽解郁顆粒藥效基礎(chǔ)及抗抑郁作用機(jī)制深入研究提供方向，比如從5-HT、DA 等神經(jīng)遞質(zhì)代謝出發(fā)探究溫陽解郁顆?？挂钟絷P(guān)鍵作用靶點(diǎn)；從體外培養(yǎng)細(xì)胞層次上具體研究分析溫陽解郁對海馬神經(jīng)細(xì)胞功能的具體調(diào)控作用；分析溫陽解郁顆粒多條抗抑郁通路的相互作用等。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對溫陽解郁顆粒的藥味化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和其抗抑郁通路作用分析進(jìn)行了探索性研究，從中可以看出溫陽解郁顆?？挂钟糁委煹奶攸c(diǎn)為多組分、多靶點(diǎn)、通路交互、協(xié)同作用。但在某些方面存在一定局限，比如利用藥代動力學(xué)參數(shù)篩選活性成分時(shí)，某些藥物主成分會被剔除，反映出溫陽解郁顆粒復(fù)方中其他藥味也可能存在有效活性成分未被發(fā)掘的情況，故后期研究應(yīng)不斷深入與補(bǔ)充，并對現(xiàn)發(fā)掘的藥物成分進(jìn)行具體的藥效基礎(chǔ)研究，增加科學(xué)研究的可行性、準(zhǔn)確度，為后期課題組對溫陽解郁顆粒藥味物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制通路驗(yàn)證等具體實(shí)驗(yàn)研究提供方向與參考，為中藥抗抑郁研究提供思路。