王 康，蔣 勇，劉緒銀，廖懷章，盧 敏，曾 凡

（1. 湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2. 邵陽正大骨傷科醫(yī)院，湖南 邵陽 422900；3. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410007）

踝關節(jié)損傷是最常見的肌肉骨骼疾?。?］，踝關節(jié)韌帶的牽拉或撕裂是急性踝關節(jié)損傷的特征，踝關節(jié)外側韌帶扭傷是最常見的踝關節(jié)損傷類型［2-4］。一項薈萃分析［5］顯示外側韌帶的損傷發(fā)生率為0.93/1 000。大約50%的患急性踝關節(jié)損傷者無視該病，在短時間恢復活動，導致其復發(fā)率高，最終發(fā)展成為慢性踝關節(jié)不穩(wěn)［6］?；钛隼绞巧坳栒蠊莻漆t(yī)院臨床經(jīng)驗名方，在活血化瘀止痛的基礎上予以利水消腫，臨床治療急性踝關節(jié)損傷具有良好的療效，能減輕局部的炎癥［7-9］。為探討活血化瘀利水方治療急性踝關節(jié)損傷的作用機制，本文研究了活血化瘀利水方對急性軟組織損傷大鼠模型血清NF-κB P65、TAK1 的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物采用SD 雄性大鼠48只，體質量180～220 g，SPF 級，均由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心統(tǒng)一代購，動物供應商編碼GYS-202009070001。實驗中對動物處置符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定，實驗倫理審核批號：LLBH-201909260001。

1.1.2 實驗用藥 實驗組藥物為活血化瘀利水方煎液，藥物組成包括當歸尾15 g、白茅根15 g、川芎12 g、丹皮12 g、赤芍12 g、紅花10 g、茯苓12 g、三七3 g、澤蘭12 g、水蛭7 g、地龍9 g、生地黃12 g 、木通6 g、土鱉蟲10 g、甘草6 g。由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房代煎。采用旋轉蒸發(fā)儀將藥液濃縮至1.03、2.06、4.12 g/mL 3 個濃度。

陽性對照組藥物為舒筋活血膠囊，購自湖南安邦制藥有限公司，國藥準字號：Z20090575。加無菌蒸餾水配置成濃度0.2 g/mL 混合液，4℃保存。

1.1.3 實驗儀器及試劑 自制軟組織打擊器；10%的水合氯醛；旋轉蒸發(fā)儀；搖床（中國江蘇其林貝TS-1）；臺式冷凍離心機（中國湖南湘儀H1650R）；電泳儀（中國北京六一DYY-6C）；電泳槽（中國北京六一DYCZ-24DN）；轉膜儀（中國北京六一DYCZ-40D）；旋渦混合器（中國江蘇其林貝爾GL-88B）；磁力攪拌器（中國雷磁JB-13）普通冰箱（中國奧克斯BCD-196A）；電磁爐（荷蘭飛利浦HD4925）精密PH計（中國雷磁PHS-3C）；電子天平（美國雙杰JJ224BC）；生物樣品均質儀（中國杭州奧盛Bio-Prep-24）；熒光定量RCP 儀（美國Thermo PIKOREAL96）熒光PCR 板（美國Thermo SPL0960）；電泳儀（中國北京六一DYY-2C）；水平瓊脂糖電泳槽（中國北京六一DYCP-31DN）；-80℃冰箱（中國美菱DW-HW438）。

1.2 方法

1.2.1 分組及藥物干預 48 只SD 雄性大鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為空白對照組（A 組），模型對照組（B 組）、舒筋活血膠囊水溶液（C 組）、活血化瘀利水方低劑量組（D 組）、活血化瘀利水方中劑量組（E 組）、活血化瘀利水方高劑量組（F 組）。造模成功后，各組大鼠第2 天開始按1.5 mL/100 g 灌胃給藥，活血化瘀利水方低、中、高劑量組分別按15.5、31.0、62.0 g/kg 給予活血化瘀利水方低、中、高劑量煎液（分別為標準劑量的1、2、4 倍），其中空白對照組、模型組灌胃蒸餾水3 mL，1 d 1 次，連續(xù)1 周。

1.2.2 動物造模 參考孫燕等［10］造模方法，采用重錘墜落法造模，將大鼠的右踝用脫毛膏脫毛后固定在木板上，將0.2 kg 重砝碼從45 cm 高處通過塑料管砸在大鼠右踝同一部位，連續(xù)打擊3 次，打擊面積為π×1.5 cm2，造出打擊局部出現(xiàn)散在出血點，打擊處腫脹，皮下瘀斑但無皮膚破損；用手觸摸右下肢無骨折及脫位征；無其它異常情況發(fā)生者確定為造模成功。

1.2.3 實驗取材 連續(xù)給藥干預7 d 后取標本，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g）。取踝關節(jié)外側軟組織，剝離，切除，生理鹽水沖洗，取部分組織塊泡于10%多聚甲醛中用于HE 染色，部分組織轉移至-80℃冰箱暫存。

1.2.4 HE 染色 60℃恒溫2 h 烤片。切片多次浸入二甲苯及不同濃度系列乙醇后脫蠟，蒸餾水沖洗。蘇木素染液及伊紅染液中染色。切片經(jīng)無水乙醇系列脫水，二甲苯透明后，樹膠封片。光鏡鏡檢，采集分析圖像。

1.2.5 蛋白免疫印跡法測定大鼠踝關節(jié)軟組織P65、TAK1 表達水平 取0.025 g 已保存的組織標本，使用冰預冷PBS 清洗，在生物樣品均質儀中加入300 μL RIPA 裂解液，兩者混合后充分研磨組織直至無法肉眼看見較大組織塊。冰上裂解10 min。溫度4℃，轉速12 000 r/min 的離心機中離心15 min。使用1.5 mL 的離心管保存離心后的上清液。

加入TEMED 后立即搖勻，灌入配置好的10%分離膠。灌膠后，使用異丙醇對其進行封膠。當微微傾斜制膠器分界線不再變化時說明條件已經(jīng)達到。再等待3～5 min 后，倒去膠上層的異丙醇，并使用濾紙將其盡可能吸干。再次加入TEMED 后搖勻，灌入4.8%的濃縮膠。將梳子插入玻璃板中，濃縮膠將剩余空間灌滿，等待膠凝固即可。

取240 μL 蛋白上清，加入60 μL 5×loading buffer 混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。

第一孔點入marker 2 μL，其它每孔上樣10 μL已變性蛋白。開始電泳，電泳恒定電壓76 V，時間為2.5 h。待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。

分別切膠TAK1（75 kD），P65（64 kD），β-actin（42 kD）。準備6 張與膠相同面積大小的濾紙和1張NC 膜，NC 膜與濾紙同時完全浸透到轉膜緩沖液中。按照最上層3 張濾紙，NC 膜，膠，另3 張濾紙在下的順序依次放好，嚴格要求每一層間隔之間沒有氣泡。蓋上儀器，接通電源，轉膜300 mA 恒定電流，P65 約85 min，TAK1 約95 min，β-actin 約60 min。轉膜完成后，將其放入1×PBST 中洗1 次。

將膜浸入1×PBST 配制5%的脫脂奶粉中，在室溫環(huán)境中存放90 min 后，再換入4℃的環(huán)境過夜，次日再放于室溫30 min。

用1×PBST 稀釋HRP 標記的二抗，將稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育90 min；孵育結束，1×PBST 洗3 次，每 次10 min。使 用ECL 化 學 發(fā) 光 液顯色曝光。用1×PBST（注：CST 的抗體需要用5%BSA 的1×PBST 稀釋）將一抗按照一定比例稀釋，將膜與一抗一起孵育，室溫放置90 min 。孵育結束，1×PBST 洗3 次，每次15 min。

1.2.6 實時熒光定量PCR 法檢測大鼠踝關節(jié)軟組織P65、TAK1表達水平 在121℃溫度下濕熱滅菌20 min 的三蒸水中1 L 加入1 mL 的DEPC，立即搖勻，過夜后成為0.1%DEPC 水。準備器械。剪取0.02 g 組織，用遇冷的PBS 洗一次，加1 mL Trizol于1.5 mL 離心管中，生物勻質儀勻漿，室裂解5 min；加入200 μL 三氯甲烷，劇烈振蕩15 s 使之充分混合后，在室溫的環(huán)境中靜置3 min；設置離心機速度為12 000 r/min，在4℃的溫度下，離心15 min。使用RNase-Free 離心管將其上層液保存；在裝有上層液的離心管內加入與之相同體積的異丙醇，充分混合均勻，室溫環(huán)境下靜置10 min；設置離心機速度12 000 r/min，在4℃環(huán)境下，離心10 min，去除上清液后，加入1 mL 75%乙醇（無菌DEPC 處理水配制）洗滌離心管內沉淀；再次設置12 000 r/min，4℃溫度，離心3 min，再次去除上清液；將離心管在空氣干燥5～10 min 后。在管內加入20～30 μL 無菌無酶水，使管內沉淀溶解；紫外分光光度計測定濃度，RNA 濃度（ng/μL）=A260×稀釋倍數(shù)×40，結果在100～200 ng/μL，RNA 純度=OD260/OD280，結果在1.8～2.0 之間表明RNA 純度良好。

使 用0.30 g 瓊 脂 糖 以 及30 mL 的1×TAE 加熱至瓊脂糖溶解，室溫冷卻至60℃，在容器內加入0.5 μL 核酸染料，充分混合后倒膠，使其配制成為1%瓊脂糖凝膠；取5 μL 已經(jīng)提取完成的RNA，使用6×loading buffer 與其5∶1 的比列混勻，在140 V恒壓下進行電泳，溴酚藍前沿遷移至凝膠總長2/5處停止電泳；凝膠成像系統(tǒng)下觀察。條帶由上至下依次為28、18、5 s。以組織總mRNA 為模板，逆轉錄cDNA。引物信息見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 組織病理變化情況

大鼠局部踝關節(jié)軟組織標本HE 染色結果如圖1 所示，空白組（圖1A）大鼠軟組織結構清晰，肌細胞分解明顯，未見充血、炎癥細胞浸潤。服藥7 d 后模型組（圖1B）大鼠軟組織肌細胞萎縮、點狀壞死，炎細胞浸潤，纖維組織增生較前增多。陽性組（圖1C）肌細胞萎縮、點狀壞死，炎細胞灶性浸潤，纖維組織增生，伴出血?；钛隼降蛣┝拷M（圖1D）肌細胞萎縮，炎細胞灶性浸潤，纖維組織增生。活血化瘀利水方中劑量組（圖1E）肌細胞萎縮，纖維組織增生?；钛隼礁邉┝拷M（圖1F）炎細胞灶性浸潤，纖維組織增生。活血化瘀利水方中劑量組肌細胞萎縮，纖維組織增生。

圖1 大鼠的踝關節(jié)周圍軟組織HE 染色（400×）Fig 1 HE staining of soft tissue around the ankle joint in rats（400×）

2.2 Western blotting 對大鼠踝關節(jié)軟組織P65、TAK1 蛋白表達的影響。

造模后1 天，模型組、陽性藥物組及低、中、高劑量活血化瘀利水方的P65、TAK1 蛋白與空白對照組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。用藥7 d 后，與模型組相比，舒筋活絡膠囊組及低、中、高劑量活血化瘀利水方組服藥后P65、TAK1 蛋白均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。活血化瘀利水方中、高劑量組與舒筋活血膠囊組差異有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表2，圖2、3）。

圖2 造模后1 d 大鼠踝關節(jié)軟組織P65、TAK1 蛋白表達Fig 2 Expression of P65 and TAK1 protein in the soft tissues of the ankle joint of rats one day after modeling

表2 各組大鼠踝關節(jié)造模后1 天踝關節(jié)軟組織中P65、TAK1 蛋白的比較（n=8,±s）Tab 2 Comparison of P65 and TAK1 proteins in the soft tissues of the ankle joint（n=8,±s）

表2 各組大鼠踝關節(jié)造模后1 天踝關節(jié)軟組織中P65、TAK1 蛋白的比較（n=8,±s）Tab 2 Comparison of P65 and TAK1 proteins in the soft tissues of the ankle joint（n=8,±s）

注：與空白組對比，*P＜0.05；與模型組對比，#P＜0.05；與舒筋活血膠囊組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組舒筋活血膠囊活血化瘀利水方低劑量組活血化瘀利水方中劑量組活血化瘀利水方高劑量組P65 TAK1治療后15.20±0.81 94.91±3.89 38.76±4.34#32.16±3.72#23.01±3.82#▲17.56±3.07#▲219.96＜0.05 FP治療前12.26±3.11 53.65±4.27*51.57±2.65*55.67±1.93*57.50±5.10*59.63±13.55*23.30＜0.05治療后8.02±4.01 70.55±8.38 45.72±8.69#34.39±7.70#22.24±6.06#▲15.20±1.71#▲36.32＜0.05治療前13.32±4.21 67.19±10.01*62.04±5.91*57.87±2.40*58.30±7.45*58.55±6.13*27.75＜0.05

2.3 熒光定量PCR 對大鼠踝關節(jié)軟組織P65、TAK1 mRNA 表達的影響

造模后1 d，模型組、陽性藥物組及低、中、高劑量活血化瘀利水方的P65、TAK1mRNA 與空白對照組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。用藥7 d 后，與模型組相比，舒筋活絡膠囊組及低、中、高劑量活血化瘀利水方組服藥后P65、TAK1mRNA 的表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?；钛隼街?、高劑量組與舒筋活血膠囊組有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），結 果 與Western blotting 蛋 白 表 達 一致（表3）。

表3 各組大鼠踝關節(jié)踝關節(jié)軟組織中P65、TAK1 mRNA 的比較（n=8,±s）Tab 3 Comparison of P65 and TAK1 mRNA in the soft tissues of the ankle joint of rats in each group（n=8,±s）

表3 各組大鼠踝關節(jié)踝關節(jié)軟組織中P65、TAK1 mRNA 的比較（n=8,±s）Tab 3 Comparison of P65 and TAK1 mRNA in the soft tissues of the ankle joint of rats in each group（n=8,±s）

注：與空白組對比，*P＜0.05；與模型組對比，#P＜0.05；與舒筋活血膠囊組比較，▲P＜0.05。

組別P65 TAK1空白組模型組舒筋活血膠囊活血化瘀利水方低劑量組活血化瘀利水方中劑量組活血化瘀利水方高劑量組F/H P治療后1.03±0.02 7.49±0.33 3.89±0.36#2.05±0.21#1.37±0.04#▲1.15±0.02#▲1 252.91＜0.05治療前0.98±0.08 5.95±0.12*5.95±0.12*6.09±2.45*5.89±0.26*6.28±0.17*387.68＜0.05治療后1.03±0.02 7.49±0.33 3.89±0.36#2.05±0.21#1.37±0.04#▲1.15±0.02#▲16.58＜0.05治療前0.98±0.08 5.95±0.12*5.95±0.12*6.09±2.45*5.89±0.26*6.28±0.17*2.25＜0.05

圖3 服藥7 d 后大鼠踝關節(jié)軟組織P65、TAK1 蛋白表達Fig 3 P65 and TAK1 protein expression in soft tissue of rat ankle joint 7 days after administration

3 討論

活血化瘀利水方在臨床有顯著的療效［11-13］，中醫(yī)認為，急性踝關節(jié)損傷早期的局部腫脹的病理機制主要是瘀水互結，既有瘀血，又有水腫，故在臨床治療中以活血化瘀為基礎，加以利水、利尿藥物，療效十分顯著，臨床常用藥物包括當歸尾、白茅根、川芎、丹皮、赤芍、紅花、茯苓、三七、澤蘭、水蛭、地龍、生地黃、木通、土鱉蟲［14，15］。在當歸尾、川芎、丹皮、赤芍、紅花、三七、水蛭、地龍、土鱉蟲活血化瘀的基礎上，予以白茅根、澤蘭、木通、茯苓利水消腫，同時予以生地養(yǎng)陰，剛柔相濟，動靜有序。

中醫(yī)臨床將急性踝關節(jié)損傷診斷為“筋傷”，臨床辯證論治認為其多為“氣滯血瘀證”，病因主要由于猝然跌撲、碰撞、扭傷所致，中醫(yī)病機理論為氣滯血瘀，淤血阻絡，不通則痛，故而局部疼痛［16］?！堆C論》云“凡跌打未破皮者，其血壞損，傷其肌肉則腫痛…，凡是疼痛皆瘀血凝滯之故也”。骨骼損傷能影響周圍筋肉肌膚，肌肉肌膚損傷亦能影響骨關節(jié)結構，治療中可以遵循“筋骨肉并重”這一重要的骨傷治療原則［17］。許多學者對此也開展了廣泛的研究，如研究該證型與微循環(huán)障礙的相關性，與血液流變學改變的異同性，與炎癥反應是否存在類似的病理改變等，此外同樣在凝血-纖溶系統(tǒng)、血管內皮功能等方面也有相關研究［18］。

現(xiàn)代醫(yī)學認為炎癥反應是一種復雜的保護性生物反應［19］。當有害物質刺激機體組織時，炎癥反應就會應激性表達，這是一個重要的病理過程。在炎癥反應時，利用現(xiàn)代醫(yī)學檢測技術對血液或者相關組織進行檢測，能夠觀察炎性指標的異常。研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應與中醫(yī)的氣滯血瘀證型也密切相關［20］，如氣滯血瘀證出現(xiàn)的局部紅腫、疼痛、偶有發(fā)熱等癥狀與局部炎癥出現(xiàn)的癥狀基本一致；病理過程中炎癥反應可能會誘導血栓形成、血管損傷、淤血、流變學改變等多種病理反應，與氣滯血瘀證的病理表現(xiàn)十分相似；發(fā)病原因也有相同之處。有研究在臨床中通過對血瘀證患者的生化指標檢測發(fā)現(xiàn)，與炎癥相關的一些因子均在疾病前、后表現(xiàn)出差異［21，22］。

急性踝關節(jié)損傷后，局部毛細血管通透性增高甚至導致出血、細胞內液滲出，致使局部腫脹、疼痛，或有青紫瘀斑等癥狀。數(shù)小時后IL-1β、TNF-α等炎性介質釋放，隨即刺激神經(jīng)末稍，從而產(chǎn)生疼痛。炎癥是宿主對感染和組織損傷的一種保護性反應，其特征是一系列反應，包括免疫細胞和血漿蛋白在感染或組織損傷部位的血管擴張和補充［23］。NF-κB 信號通路作為調節(jié)炎癥反應的關鍵通路，在細胞的生長、凋亡等病理、生理過程中的作用是巨大的［24］。NF-κB 二聚體通過與NF-κB 抑制劑結合在一起而處于失活狀態(tài)，在靜息狀態(tài)下，NF-κB 蛋白在細胞胞質中保持穩(wěn)定，在局部炎癥及其他應激反應下，NF-κB 抑制劑被磷酸化［25］。解除了抑制劑對NF-κB 信號通路的抑制，進而導致NF-κB 蛋白的釋 放 以 及 活 化［26］。TAK1 作 為NF-κB 信 號 通 路 關鍵的上游因子，能夠被轉化生長因子-β、Toll 樣受體等多種因素激活［27］。TAK1 可以激活IKK 復合物，促進IκB 的磷酸化和降解，使NF-κB 蛋白游離、活化入核，誘導IL-1 等炎性細胞因子的表達［28，29］。愈淵等［30］通過動物實驗，證明中藥復方大黃仙靈方可以治療膽管結石，改善其慢性炎癥狀態(tài)，通過檢測，該方可以降低NF-κB 通路中某些蛋白表達，其中包括TAK1 蛋白。吉加釵等［31］通過小鼠動物實驗，發(fā)現(xiàn)環(huán)指蛋白4 可以減輕心肌梗死后局部的炎癥發(fā)應，通過檢測，環(huán)指蛋白4 也同時降低了TAK1 蛋白的表達。賴莉等［32］通過細胞實驗研究黃芪多糖對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的炎癥反應中發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在改善視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞炎癥的同時也降低了TAK1蛋白的水平。本次研究發(fā)現(xiàn)局部軟組織中的TAK1的水平降低，提示TAK1 可能作為上游因子激活某一信號通路來控制炎癥反應，以達到改善局部炎癥，最終治療踝關節(jié)損傷。NF-κB 家族在靜息的情況下通常是以二聚體的形式存在，在其多種多樣的二聚體當中，以P50/P65 這種二聚體形式最常見，相對于其它形式的二聚體，總量也是最多［33］。當一定特殊的病理條件及因子激活通路導致IκB 磷酸化后，則會引起這些二聚體的繼發(fā)反應。由于P50 亞基 本 身 擁 有 核 定 位 信 號，IκB 在 降 解 后，P50 連 同P65 移入細胞核內。P65 在進入細胞核內后發(fā)揮著它的作用，識別并結合特定的DNA，對靶基因轉錄有調控作用［34，35］。李建設等［36］通過對大鼠膠質細胞的研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠降低一氧化氮合酶、白介素-1β、TNF-α 等 炎 癥 因 子 表 達 的 同 時，對NF-κB P65 的表達也有影響。且這些因子在同一階段的表達趨勢相同。本次研究發(fā)現(xiàn)局部軟組織中的P65 蛋白的水平降低，提示P65 可能作為下游因子參與反應從而達到控制炎癥反應，以達到改善局部炎癥，最終治療踝關節(jié)損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在急性踝關節(jié)損傷大鼠中，TAK1/NF-κB P65 信 號 通 路 激 活 提 示TAK1/NF-κB P65 信號通路參與了踝關節(jié)損傷病程的發(fā)展，同時，活血化瘀利水方對于TAK1、NF-κB P65蛋白有一定的干預作用，提示活血化瘀利水方可能通過干預NF-κB 信號通路來治療踝關節(jié)損傷。這為中醫(yī)藥治療急性踝關節(jié)損傷在分子機制上提供了思路。

本次研究存在一定的局限性：（1）研究中各組的樣本量少，樣本量少會對實驗結果產(chǎn)生偏倚［37］；（2）本文中所研究的蛋白是NF-κB 通路中具有代表性的蛋白，但是由于所研究的蛋白數(shù)量少，不能完整的體現(xiàn)活血化瘀利水方治療急性踝關節(jié)損傷的作用機制與NF-κB 通路的關系；（3）本次研究以實驗室指標為主，缺少對局部癥狀以及中醫(yī)證候的研究。在未來的研究中，課題組繼續(xù)以活血化瘀利水方為基礎，充分研究其在分子水平上的作用機制，并且擴大樣本量，減少因樣本數(shù)所帶來的結果偏倚，在實驗室指標的基礎上，增加對于體征癥候的觀察，增加結果的穩(wěn)定性。

作者貢獻度說明：

王康、曾凡、蔣勇：參與動物實驗，指標檢測，撰寫論文；廖懷章：實驗指導，實驗負責人；劉緒銀、盧敏：論文指導。