楊闖，邢志超，李境藝，李帥，于靖輝，王俊玲

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院（吉林 132101）

發(fā)芽糙米是一種具有全營養(yǎng)概念及特殊營養(yǎng)價值的功能性主食或配料[1]。發(fā)芽糙米制備工藝研究是實現(xiàn)發(fā)芽糙米產(chǎn)業(yè)化的首要環(huán)節(jié)[2]。糙米酵素是以糙米為營養(yǎng)來源，加入一定量的蜂蜜、玉米胚油，利用酵母菌發(fā)酵制得的[3]。經(jīng)過發(fā)酵后，其中所含有的γ-氨基丁酸（GABA）等生理活性成分含量均顯著提高。

植酸，因其含有6個磷酸基團，又被稱為肌醇六磷酸，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有很強的金屬螯合能力，與金屬反應(yīng)容易產(chǎn)生不易溶解的鹽類[4]。植酸酶，是能將磷酸殘基從植酸上水解下來的一類酶的總稱[5]，廣泛存在于植物、微生物、動物組織中，微生物中的細菌、酵母菌和霉菌都可以產(chǎn)生植酸酶[6]。植酸酶的使用可替代飼料中所添加的無機磷，從而可以緩解中國磷資源匱乏、磷供應(yīng)不足的局面，其社會效應(yīng)顯著[7]。

植酸酶和GABA是糙米酵素中的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，因此，試驗以發(fā)芽糙米為原料，利用酵母菌發(fā)酵制備糙米酵素，以植酸酶酶活力和γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度為指標(biāo)探究最佳發(fā)酵條件，為進一步提高糙米酵素中的營養(yǎng)成分及生產(chǎn)糙米酵素相關(guān)食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯、糙米等（市售）；安琪活性干酵母（市售）；次氯酸鈉、氯化鈣、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、氯化鈉、γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、碳酸鈉、四硼酸鈉、苯酚、乙醇、瓊脂、蔗糖、磷酸二氫鉀、植酸鈣、鉬酸銨、釩酸銨、硝酸、乙酸等（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（三洋電機株式會社）；SW-CJ-2FD凈化工作臺（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；UV-2700紫外分光光度計（日本島津公司）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；DK-V205三用恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HC-100T多功能粉碎機（河城工貿(mào)有限公司）；GL-20G-Ⅱ高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 糙米的預(yù)處理

參照侯利娟等[8]的方法處理后，備用。

1.4 菌種的制備

將酵母菌接種到2%蔗糖溶液中，調(diào)節(jié)pH 4.5～5.0，于38 ℃水浴30 min，于恒溫搖床中培養(yǎng)過夜。第2天，將其接種至PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。第3天，培養(yǎng)基上生長出菌落后，篩選出長勢良好、活力旺盛、表面光滑有光澤的單菌落，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜即為可直接用于接種的酵母菌菌種。

1.5 植酸酶酶活力測定

無機磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9-10]：按需求精確稱取已烘至恒重的KH2PO4粉末，充分溶解，用容量瓶定容，制備成濃度50.0 mmol/L的KH2PO4溶液。將配制好的KH2PO4溶液按比例稀釋成25，12.5，6.25，3.125和1.5625 mmol/L不同梯度濃度。分別取0.1 mL不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入0.9 mL 0.25 mol/L的乙酸緩沖液，充分振蕩后，在37 ℃水浴鍋中放置5 min，依次加入2 mL 7.5 mmol/L的植酸鈣溶液，充分振蕩后，放置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，向各個反應(yīng)體系中分別加入2 mL提前配制好的釩鉬終止液，充分混勻，在波長415 nm處測定吸光度。繪制相應(yīng)的無機磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活性單位（U）定義為在37 ℃的條件下，每分鐘從0.005 mol/L的植酸鈣溶液中釋放出1 nmol無機磷所需要的酶量為1個酶活單位。

樣品中植酸酶酶活力的測定[11]：將所制得的樣品離心，取其上清液，按照表1反應(yīng)順序進行反應(yīng)，在波長415 nm處測定吸光度。將所測定的吸光度代入到所制得的方程中，同時結(jié)合所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中無機磷濃度，進而計算出樣品中植酸酶酶活力。

1.6 GABA的測定

1.6.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于冰浴中，加入0.2 mL 1.0 mol/L碳酸鈉溶液，1.0 mL 0.01 mol/L四硼酸鈉緩沖液，終止反應(yīng)。加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的苯酚溶液，5.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%的次氯酸鈉溶液，充分振蕩混勻后放置于沸水浴中反應(yīng)10 min，為防止試管破碎，先用流水冷卻后，放置于冰水浴中冷卻20 min。等待試管中的反應(yīng)體系出現(xiàn)藍綠色后加入2.0 mL 60%乙醇，充分振蕩混勻后在波長640 nm處測定吸光度。繪制相應(yīng)的GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 樣品中GABA的測定

參考Berthelot比色法[12]，并做出一些改進，從而對GABA質(zhì)量濃度進行測定，將樣品離心，取其上清液，按照表2反應(yīng)順序進行反應(yīng)，在波長640 nm處測定吸光度。將所測定的吸光度代入到所制得的方程中，同時結(jié)合所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中GABA質(zhì)量濃度?？瞻坠苤胁缓珿ABA，操作同樣品管。

表2 GABA含量測定反應(yīng)流程

2 結(jié)果與分析

2.1 無機磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以無機磷濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的無機磷標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得到方程y=0.04x-0.0233，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9974。

圖1 無機磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

繪制GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2），其中橫坐標(biāo)為GABA質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度（A），得到方程y=1.6916x+0.0339，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9959。

圖2 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 植酸酶單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1 培養(yǎng)溫度對植酸酶的影響

從25 ℃開始依次選取4個不同培養(yǎng)溫度，在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌種，在120 r/min條件下發(fā)酵6 h，每個條件做3次平行，分別測定其植酸酶酶活力。

分析圖3可得：植酸酶酶活力在25～35 ℃范圍內(nèi)逐漸增加，植酸酶酶活力的峰值點是溫度達到35 ℃時，此時的吸光度為0.216，植酸酶酶活力為19.98 U/mL。溫度高于35 ℃，植酸酶酶活力逐漸下降，適宜的溫度是增加營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成的必要條件，太高或者太低的溫度均會使酶活受到影響。所以正交試驗選取培養(yǎng)溫度30，35和40 ℃這3個水平。

圖3 培養(yǎng)溫度對植酸酶的影響

李海燕等[13]通過黑曲霉植酸酶發(fā)酵工藝優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的最適發(fā)酵溫度為30 ℃，此時植酸酶酶活最高為19.02 U。若培養(yǎng)溫度與菌體的適宜溫度相差較大，都會對菌體的生長代謝產(chǎn)生影響。出現(xiàn)此種情況，主要是因為菌種不同造成的。

楊燕凌等[14]通過對Aspergullus nigerFZ41產(chǎn)植酸酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究發(fā)現(xiàn)，從20 ℃開始，依次遞增5 ℃的5個發(fā)酵條件中，植酸酶酶活在30℃時達到峰值，在20 ℃時達到最低，在25 ℃和35 ℃時都有所下降，因此得出最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。出現(xiàn)此種情況，推測原因可能是所使用菌種有所差異。

2.3.2 培養(yǎng)時間對植酸酶的影響

從6 h開始依次選取5個不同培養(yǎng)時間，在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌種，在30 ℃、120 r/min條件下分別發(fā)酵不同的時間，每個條件做3次平行，分別測定其植酸酶酶活力。

分析圖4可得：培養(yǎng)時間在6～8 h范圍內(nèi)，植酸酶酶活力隨著培養(yǎng)時間增加而增加。植酸酶酶活力在培養(yǎng)時間8 h時達到峰值，此時的吸光度為0.393，植酸酶酶活力為34.73 U/mL。培養(yǎng)時間大于8 h，隨著培養(yǎng)時間增加而下降，分析其原因有可能是培養(yǎng)時間越長，培養(yǎng)條件越不適合于菌體生長。另外產(chǎn)物的合成主要在酵母菌生長的穩(wěn)定期，培養(yǎng)時間越長，酵母菌可能進入衰亡期。因此正交試驗中培養(yǎng)時間選取6，8和10 h這三水平。

圖4 培養(yǎng)時間對植酸酶的影響

何錫杲[15]研究不同發(fā)酵條件對植酸酶基因工程菌E-22產(chǎn)植酸酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種時間12～48 h時，所得植酸酶酶活力雖然有起伏但相差不大，接種時間36 h左右植酸酶酶活力最高。出現(xiàn)這種情況的原因推測是其所用菌種與試驗不同，不同菌種的最適生長條件不同，所以造成試驗結(jié)果不同。

田運佳[7]通過對植酸酶生產(chǎn)過程中主要影響因素的研究發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)時間16～24 h時，植酸酶酶活力呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，培養(yǎng)時間20 h時發(fā)酵液植酸酶酶活力達到峰值。

2.3.3 接種量對植酸酶的影響

在糙米培養(yǎng)基中接種5個不同接種量，將未接種菌種的培養(yǎng)基作為空白對照組。在30 ℃、120 r/min條件下發(fā)酵6 h，每個條件做3次平行，分別測定其植酸酶酶活力。

分析圖5可得：接種量0～4%范圍內(nèi)，植酸酶酶活力隨著接種量增加而增加。植酸酶酶活力達到峰值時的酵母菌接種量為4%，此時的吸光度為0.247，植酸酶酶活力為22.50 U/mL。隨著接種量繼續(xù)增加，植酸酶酶活力下降，分析其原因可能是隨著接種量增加，酵母菌的菌體密度增大，導(dǎo)致培養(yǎng)基濃度達不到適用于菌體生長的最佳濃度，轉(zhuǎn)化效率降低，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。因此在正交試驗中接種量選取3%，4%和5%這三水平。

圖5 接種量對植酸酶的影響

趙海霞等[16]通過植酸酶基因工程酵母PP-NP～m-8培養(yǎng)條件研究發(fā)現(xiàn)，接種量3%～5%時，酵母不僅生長較好且接種量3%時培養(yǎng)液中酶含量最高，故接種量3%最佳。與試驗結(jié)果不同，可能是使用菌種與其不同。

劉雙赫等[17]通過對醋糟固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)植酸酶工藝的研究發(fā)現(xiàn)：植酸酶酶活力隨接種量增加而增加，接種量4%時，酶活達到最大值，為2.4 U/mL，接種量大于4%后，酶活隨著接種量增加而降低，因此最佳接種量為4%。

2.4 GABA單因素試驗結(jié)果與分析

2.4.1 培養(yǎng)溫度對GABA的影響

從25 ℃開始依次選取4個不同的溫度條件，在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌種，在120 r/min條件下發(fā)酵6 h，每個條件做3次平行，分別測定其GABA質(zhì)量濃度。

分析圖6可得：培養(yǎng)溫度25～30 ℃時，GABA質(zhì)量濃度隨著溫度升高而增加。GABA產(chǎn)量最高時所對應(yīng)的培養(yǎng)溫度為30 ℃，此時的吸光度為0.611，GABA含量為0.341 mg/mL。之后隨著溫度升高，GABA含量開始逐漸下降，太高或者太低的溫度都會使GABA含量受到影響。所以正交試驗選取培養(yǎng)溫度25，30和35 ℃這3個水平。

圖6 培養(yǎng)溫度對GABA的影響

雷恒[18]在高產(chǎn)GABA的紅曲菌種選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，在固態(tài)發(fā)酵條件下，GABA含量最高時，培養(yǎng)溫度為30 ℃。之后隨著溫度升高，GABA產(chǎn)量降低，溫度越高GABA產(chǎn)量下降越明顯?？赡苁歉邷貙ξ⑸矬w內(nèi)生物活性物質(zhì)產(chǎn)生影響的緣故。

朱曉立等[19]在乳酸乳球菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA的條件優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸乳桿菌在26，28，30，32，34和36 ℃培養(yǎng)溫度中，最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃，GABA產(chǎn)量可達8.31 g/L。這表示GDA酶的適宜溫度為30℃，若培養(yǎng)溫度與GAD酶的適宜溫度相差較大，會導(dǎo)致GAD酶活力下降。

2.4.2 培養(yǎng)時間對GABA的影響

在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌種，在30 ℃、120 r/min條件下發(fā)酵6，8，10，12和14 h，每個條件做3次平行，分別測定其GABA質(zhì)量濃度。

分析圖7可得：在一定范圍內(nèi)GABA質(zhì)量濃度隨培養(yǎng)時間增加而增加。培養(yǎng)時間8 h時，GABA質(zhì)量濃度達到最大值，此時的吸光度為0.494，植酸酶酶活力為0.272 mg/mL。隨著培養(yǎng)時間繼續(xù)增加，植酸酶酶活力下降，分析其原因可能是培養(yǎng)時間越長，培養(yǎng)條件越不適合于菌體生長。另外產(chǎn)物的合成主要在酵母菌生長的穩(wěn)定期，培養(yǎng)時間越長，酵母菌可能進入衰亡期。因此正交試驗中培養(yǎng)時間選取6，8和10 h這三水平。

圖7 培養(yǎng)時間對GABA的影響

上官文菲等[20]在響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)GABA的培養(yǎng)條件研究中發(fā)現(xiàn)，乳桿菌菌種SD2112在48，60，72，84和96 h的發(fā)酵時間中，最佳發(fā)酵時間為72 h，發(fā)酵時間＞72 h后，GABA產(chǎn)量趨于平緩，可能是由于發(fā)酵后期菌體進入穩(wěn)定生長期，需將培養(yǎng)基中的底物緩慢轉(zhuǎn)化。與試驗結(jié)果不同，可能是因為菌種不同的影響。

2.4.3 接種量對GABA的影響

在糙米培養(yǎng)基中接種5個不同酵母菌種，將未接種菌種的培養(yǎng)基作為空白對照組。在30 ℃、120 r/min條件下發(fā)酵6 h，每個條件做3次平行，分別測定其GABA含量。

分析圖8可得：在接種量0～2%范圍內(nèi)，GABA質(zhì)量濃度隨著接種量增加而增加。GABA質(zhì)量濃度達到最大值時，對應(yīng)的接種量為2%，此時的吸光度為0.574，植酸酶酶活力為0.319 mg/mL。隨著接種量繼續(xù)增加，吸光度下降，分析其原因可能是隨著接種量增大，酵母菌大量繁殖，隨著發(fā)酵進行，代謝合成受阻，發(fā)酵產(chǎn)物生成量逐漸減少。因此在正交試驗中接種量選取1%，2%和3%這三水平。

圖8 接種量對GABA的影響

2.5 正交試驗結(jié)果與分析

2.5.1 植酸酶正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行L9(33)正交試驗，其因素與水平如表3所示。

表3 因素水平表

由正交試驗結(jié)果分析，RA＞RC＞RB，由此可得對植酸酶影響大小依次是：培養(yǎng)溫度＞接種量＞培養(yǎng)時間。最優(yōu)方案為A2B3C1，即在糙米培養(yǎng)基中接種3%酵母菌菌種，在35 ℃下培養(yǎng)10 h，此時植酸酶的吸光度為0.424，酶活力為37.28 U/mL。

表4 L9(33)正交試驗結(jié)果

2.5.2 GABA正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行L9(33)正交試驗，其因素水平表如表5所示。

表5 因素水平表

由正交試驗結(jié)果分析，RC＞RA＞RB，由此可得對GABA影響大小依次是：接種量＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間。最優(yōu)方案為A2B2C2，即在糙米培養(yǎng)基中接種2%酵母菌菌種，在30 ℃下培養(yǎng)8 h，GABA質(zhì)量濃度最高，為0.315 mg/mL，此時的吸光度為0.567。

表6 L9(33)正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

通過浸泡和厭氧處理的方法，促使糙米發(fā)芽，以提高糙米中植酸酶酶活力和GABA質(zhì)量濃度，利用酵母菌發(fā)酵制備糙米酵素。在試驗過程中，重點研究不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和接種量對發(fā)酵中植酸酶酶活力和GABA質(zhì)量濃度的影響。

由正交試驗可得：培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時間10 h、接種量3%時，植酸酶活力最高，可達37.28 U/mL。培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間8 h、接種量2%時，GABA質(zhì)量濃度最高，可達0.315 mg/mL。