周星貝，丁濤，王樹水

1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）廣東省心血管病研究所心兒科，廣東廣州510080

前言

肝素是使用最廣泛的臨床抗凝藥物之一，肝素的治療窗較窄，對(duì)不同人群的抗凝效果存在3～6倍的差異，半衰期存在4 倍差異［1］，因此在使用過(guò)程中需要格外關(guān)注藥物濃度變化。在需要拮抗肝素時(shí)，如心臟外科手術(shù)術(shù)后，常應(yīng)用魚精蛋白對(duì)肝素進(jìn)行中和［2］。魚精蛋白可與肝素形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而拮抗肝素的抗凝效果。但過(guò)量的魚精蛋白同樣會(huì)造成抗凝，因此魚精蛋白的精準(zhǔn)用藥也需要關(guān)注［3］?？筙a 因子是肝素測(cè)量的金標(biāo)準(zhǔn)，直接測(cè)量血液中的肝素，結(jié)果不受采血量與采血管中抗凝藥物的比例、患者自身凝血因子水平等因素的影響［4］。由于血液中的紅細(xì)胞、血小板等成分會(huì)影響測(cè)量結(jié)果［5］，大部分實(shí)驗(yàn)室常用的處理方法是在獲取血液后，對(duì)血樣進(jìn)行抗凝、離心，分離出血液中的固體成分，只保留血漿，再對(duì)血漿進(jìn)行抗Xa 因子檢驗(yàn)［6-7］。分離血漿這一步驟耗時(shí)耗力，加上全血樣品運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室的時(shí)間，通常在采血后需要經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)的時(shí)間才能獲得結(jié)果。而很多臨床場(chǎng)景下，要求臨床醫(yī)生實(shí)時(shí)關(guān)注患者的凝血狀態(tài)。因此，縮短血樣的處理時(shí)間是保證肝素監(jiān)測(cè)結(jié)果時(shí)效性的關(guān)鍵［8］。

微透析是一種新型的動(dòng)態(tài)采樣技術(shù)，它利用高分子膜的半透性，可以將肝素等小分子物質(zhì)從血液中分離，而將血細(xì)胞、血小板等大分子物質(zhì)留在血管內(nèi)，以此避免對(duì)血液進(jìn)行離心操作，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間［9-10］。微流控是一種僅需要微量體積的樣品就可以完成對(duì)多種生化組分進(jìn)行準(zhǔn)確、快速和大信息量檢測(cè)的新型分析手段，通過(guò)連續(xù)注射樣品及試劑，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、快速的生化分析［11-13］。微流控芯片通常長(zhǎng)寬僅數(shù)厘米，芯片的設(shè)計(jì)可以根據(jù)實(shí)際需求任意改變［14］。試劑可在芯片流道中完成樣品預(yù)處理、試劑反應(yīng)和結(jié)果檢測(cè)等步驟，大大縮短了檢測(cè)過(guò)程中的時(shí)間，節(jié)省了人力。微透析探針的采樣速率通常為1～100 μL/min；微流控芯片可對(duì)微升級(jí)的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量，正好與微透析取樣的速率配合［15］。因此，本研究將這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肝素的濃度變化及魚精蛋白中和肝素的效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所有化學(xué)品的純度規(guī)格均為分析純級(jí)。肝素鈉注射液（常州千紅）、凝血因子Xa（法國(guó), Hyphen Biomed），使用超純水配置濃度為15 μg/mL 的溶液，Xa 因子特異性熒光底物（瑞士,Pentapharm），使用超純水稀釋至0.5 mmol/L，凍干人血漿（法國(guó), Hyphen BioMed），每次使用前依說(shuō)明書向每分裝瓶中加入3 mL超純水，振蕩溶解，靜置30 min 后使用。上述所有溶液均貯存在4 ℃冰箱。PBS 緩沖液（10×）（美國(guó),Sigma-Aldrich），用超純水按水：儲(chǔ)存液體積比=9：1的比例稀釋成濃度為1×的PBS 溶液、超純水（18.2 mΩ?cm）由Direct-Q系統(tǒng)（法國(guó),Millipore）凈化并使用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾（法國(guó),Millipore）后得到。

3000kDa 微透析探針（瑞典,Microbiotech）、微量注射泵（Pump 11 Elite, 美國(guó), Harvard Apparatus）、蠕動(dòng)泵（美國(guó), Instech）、酶標(biāo)儀（Cytation 5, 美國(guó),Biotek）、熒光顯微鏡（Image.M2,德國(guó),Zeiss）、熒光圖像處理軟件Zen（德國(guó),Zeiss）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微透析探針的回收率測(cè)量在燒杯中注入濃度為1 IU/mL 的肝素溶液，底部墊加熱板，使用磁珠攪拌，使肝素溶液始終保持在37 ℃。燒杯開口用封口膜覆蓋避免水分蒸發(fā)影響肝素在溶液中的濃度。將微透析探針的半透膜完全浸沒于肝素溶液中。探針進(jìn)液口接注射泵，持續(xù)輸入透析液（即1×PBS），流速分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μL/min。探針出液口接蠕動(dòng)泵，持續(xù)向外抽吸透析樣品，抽吸速度與透析液注入流速一致。每次開始收集樣品前，微透析系統(tǒng)先平衡30 min，每次采樣持續(xù)1 h。分別采集微透析探針在不同透析液流速下得到的透析樣品。用傳統(tǒng)的抗Xa因子法，即使用酶標(biāo)儀，定量分析透析樣品中的肝素濃度，計(jì)算微透析探針在不同透析液流速條件下對(duì)肝素的回收率。實(shí)驗(yàn)分別使用相同規(guī)格的3組探針進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 微流控芯片的校準(zhǔn)本實(shí)驗(yàn)使用微流控芯片對(duì)血漿肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 IU/mL）進(jìn)行測(cè)量。微流控芯片的示意圖見圖1。芯片左側(cè)有3個(gè)流道入口，入口1：肝素標(biāo)準(zhǔn)液；入口2：Xa因子溶液；入口3：熒光底物。以1.0 μL/min的流速向芯片中注入肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.5 μL/min 的流速向芯片中注入Xa因子溶液與熒光底物。使用熒光檢測(cè)儀對(duì)觀測(cè)點(diǎn)位置進(jìn)行測(cè)量，激發(fā)光波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)450 nm。每隔30 s 讀數(shù)一次，單次檢測(cè)持續(xù)5 min。檢測(cè)完成后，所有液體從芯片右側(cè)的出口排出。記錄熒光強(qiáng)度值-肝素濃度的曲線，并計(jì)算擬合直線方程，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)依據(jù)熒光強(qiáng)度值計(jì)算肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，同時(shí)記錄從更換不同濃度肝素的血漿到觀測(cè)發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度值改變所消耗的時(shí)間，即系統(tǒng)的反應(yīng)時(shí)間。

圖1 微流控芯片示意圖Fig.1 Schematic diagram of microfluidics chip

1.2.3 微透析-微流控系統(tǒng)的性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)裝置如圖2所示。本實(shí)驗(yàn)將微透析探針浸沒于5 mL 人血漿中，啟動(dòng)注射泵，以1.0 μL/min 的流速向探針注入透析液。同時(shí)啟動(dòng)蠕動(dòng)泵以相同的速率在探針出口端抽吸樣品。微透析探針的出口直接與微流控芯片的進(jìn)樣品口連接。以0.5 μL/min 的流速向芯片中注入Xa 因子溶液與熒光底物。啟動(dòng)熒光檢測(cè)儀，對(duì)芯片觀測(cè)點(diǎn)位置的熒光進(jìn)行觀測(cè)，每30 s 讀數(shù)一次，并記錄測(cè)量到的熒光強(qiáng)度值，按回收率及標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出對(duì)應(yīng)的肝素濃度。穩(wěn)定運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)30 min 后，在10 min 內(nèi)緩慢添加肝素，直至被測(cè)血漿中的濃度升高至4 IU/min。5 min 后，向血漿中每隔5 min 注入一次0.05 mg 魚精蛋白，中和肝素直至血漿中的肝素濃度降低為0 IU/mL。在應(yīng)用微透析-微流控系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的同時(shí)，每隔5 min 從血漿中取樣，使用傳統(tǒng)的酶標(biāo)儀法對(duì)肝素濃度進(jìn)行測(cè)量。

圖2 微透析-微流控裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of microdialysis-microfluidics system

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

多組重復(fù)實(shí)驗(yàn)后計(jì)算各結(jié)果的算術(shù)平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)誤。在計(jì)算熒光強(qiáng)度-肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，首先使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)判斷二者是否線性相關(guān)。若兩者線性相關(guān)性顯著，則使用SPSS 軟件進(jìn)行線性回歸，得到擬合直線方程即標(biāo)準(zhǔn)直線方程；若線性相關(guān)不顯著，則根據(jù)具體的曲線關(guān)系，建立對(duì)應(yīng)的非線性回歸方程。在分析微透析-微流控系統(tǒng)與傳統(tǒng)的酶標(biāo)儀結(jié)果的一致性時(shí)，使用SPSS 計(jì)算兩組結(jié)果的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)。如果組內(nèi)相關(guān)系數(shù)值<0.4，認(rèn)為兩種方法獲得的結(jié)果一致性較差；如果組內(nèi)相關(guān)系數(shù)值>0.75，認(rèn)為兩種方法獲得的結(jié)果一致性高。

2 結(jié)果

2.1 微透析探針回收率測(cè)量

不同透析液流速下的微透析探針回收率見圖3。結(jié)果顯示，探針在透析液流速分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μL/min 時(shí)，平均回收率分別為47.0%、38.9%、26.8%、13.2%、4.8%，透析液流速越慢，探針的回收率也越高。但隨著流速的降低，樣品流過(guò)探針管道的時(shí)間增加，系統(tǒng)的延遲時(shí)間也隨之增加，使得透析的延遲時(shí)間變長(zhǎng)，時(shí)效性降低。為了在保證微透析時(shí)效性的基礎(chǔ)上最大限度地獲得更高的回收率，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用1.0 μL/min 作為透析液的流速進(jìn)行微透析。此時(shí)微透析探針的回收率為（38.9±2.8）%。

圖3 不同透析液流速下的微透析探針回收率Fig.3 Rate of recovery of microdialysis probe at different dialysate flow rates

2.2 微流控芯片的校準(zhǔn)

使用微流控芯片對(duì)肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)量的結(jié)果見圖4。隨著肝素濃度的升高，芯片觀測(cè)點(diǎn)位置的熒光強(qiáng)度值逐漸降低。當(dāng)肝素濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 IU/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度均值分別為15 111.3、13 338.3、11 635.2、10 090.5、8 296.0、6 550.3。計(jì)算熒光強(qiáng)度均值與肝素濃度的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.999 8（P<0.05），表明兩者線性相關(guān)性顯著。使用SPSS軟件進(jìn)行線性回歸，得到擬合直線方程為：y=-1 699.3x+15 085R2=0.999 6。本實(shí)驗(yàn)還記錄了從更換被測(cè)溶液到系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到熒光強(qiáng)度變化所用的時(shí)長(zhǎng)為16 min，即系統(tǒng)的響應(yīng)時(shí)間為16 min。

圖4 使用微流控芯片測(cè)量肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得的肝素-熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Heparin-fluorescence standard curves generated by measuring heparin standard solution using microfluidics chip

2.3 微透析-微流控系統(tǒng)的性能評(píng)價(jià)

使用微透析-微流控系統(tǒng)及酶標(biāo)儀對(duì)5 mL 人血漿中的肝素濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，結(jié)果見圖5。在注入肝素后，通過(guò)微透析-微流控系統(tǒng)可以觀察到肝素的濃度逐漸上升，在第13分鐘時(shí)達(dá)到最高值，即4.0 IU/mL。首次加入0.05 mg 魚精蛋白后，肝素濃度降低至2.9 IU/mL。補(bǔ)加魚精蛋白后，肝素濃度降低至1.9 IU/mL。第4 次加入魚精蛋白后，肝素被完全中和，濃度降低至0 IU/mL。此時(shí)共注射魚精蛋白0.2 mg，與血漿中肝素含量的比值為1 mg 魚精蛋白：100 IU 肝素。采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)法分析微透析-微流控系統(tǒng)與傳統(tǒng)酶標(biāo)儀法測(cè)量結(jié)果的一致性，得到組內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.995（P<0.05），可認(rèn)為兩種測(cè)量方法得到的結(jié)果一致性高。

圖5 使用微透析-微流控系統(tǒng)對(duì)人血漿中的肝素濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Fig.5 Real-time monitoring of heparin concentration in human plasma using microdialysis-microfluidics system

3 討論

為了實(shí)現(xiàn)肝素的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，本研究研制了基于微透析和微流控的實(shí)時(shí)檢驗(yàn)裝置。微透析半透膜的孔徑大小通常由分子橫截量來(lái)描述，半透膜橫截量越大，對(duì)物質(zhì)的回收率越高［16］。但微孔的尺寸大，可能導(dǎo)致透析液外漏，獲得的樣品體積減少。有研究采用增加透析液膠體滲透壓的方法，一定程度上減少了透析液損失，使采樣量達(dá)到透析液注入量的76%［17］。針對(duì)這一問(wèn)題，本研究在探針的出口端外接了一個(gè)蠕動(dòng)泵，使用與透析液注射速率相同的速度對(duì)探針內(nèi)的液體進(jìn)行抽吸，平衡因注入透析液造成的半透膜內(nèi)外壓差，避免透析液外滲［17］，采樣量可達(dá)透析液注入量的100%。

微流控芯片的設(shè)計(jì)是實(shí)現(xiàn)肝素檢測(cè)功能的重要環(huán)節(jié)。肝素會(huì)抑制Xa因子的活性，進(jìn)而抑制Xa因子對(duì)熒光底物的作用，實(shí)現(xiàn)肝素濃度轉(zhuǎn)化光學(xué)信號(hào)的過(guò)程［18］。芯片設(shè)計(jì)將肝素樣品先與Xa 因子混合，然后再向該混合物中引入熒光底物。樣品與試劑的混合順序可直接影響芯片測(cè)量的準(zhǔn)確性。用于分析其他藥物的微流控芯片通常將多種試劑同時(shí)與被測(cè)樣品混合反應(yīng)［19］，但在本實(shí)驗(yàn)中，如果將3 種液體同時(shí)混合，Xa 因子會(huì)同時(shí)分別與肝素和熒光底物反應(yīng)。此時(shí)本應(yīng)該被肝素抑制、但尚未與肝素接觸的Xa 因子提前與熒光底物接觸，而熒光底物激活的反應(yīng)過(guò)程不可逆。這種情況下，芯片中觀測(cè)到的熒光會(huì)高于實(shí)際的強(qiáng)度值，為測(cè)量帶來(lái)誤差。因此，本實(shí)驗(yàn)選用先將肝素、Xa因子充分反應(yīng)混合后，再引入熒光試劑的設(shè)計(jì)，保證肝素測(cè)量的準(zhǔn)確性。此外，微流道的設(shè)計(jì)中還加入了S型的流道，保證流道中液體的有效接觸、完全反應(yīng)。

通過(guò)向血漿中加入肝素，模擬患者注射肝素后血藥濃度上升的過(guò)程，再加入魚精蛋白中和肝素，使用微透析-微流控系統(tǒng)對(duì)整個(gè)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。魚精蛋白能與肝素結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻止肝素與Xa因子反應(yīng)，從而拮抗肝素的抗凝作用［20］。目前臨床常用計(jì)算魚精蛋白用量的方法為魚精蛋白滴定法，需要將患者的全血樣品分別與不同濃度的魚精蛋白混合。若魚精蛋白濃度不足，殘留的肝素會(huì)抑制凝血，而過(guò)量的魚精蛋白同樣有抗凝效果［3］。因此可根據(jù)最早出現(xiàn)凝血的實(shí)驗(yàn)組魚精蛋白的濃度估算最佳的魚精蛋白用藥量［21］。魚精蛋白滴定法測(cè)量肝素的精度取決于實(shí)驗(yàn)組間的魚精蛋白梯度差。臨床通常采用6 個(gè)魚精蛋白濃度，梯度為0.7 IU/mL。測(cè)量結(jié)果較真實(shí)水平有0.1～0.3 IU/mL 的波動(dòng)，按照體外循環(huán)的肝素濃度為3～4 IU/mL 計(jì)算，最大可能會(huì)有10%的誤差，無(wú)法保證用藥的安全性［3］。

本研究闡述的微透析-微流控系統(tǒng)可對(duì)肝素濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，使用者可直觀地觀察肝素濃度的變化，及時(shí)調(diào)整肝素與魚精蛋白的給藥方案，減少臨床不良事件的發(fā)生。該系統(tǒng)測(cè)得的肝素濃度與傳統(tǒng)酶標(biāo)儀方法測(cè)得的結(jié)果一致性高，組內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.995（P<0.05），證明了該系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究將微透析與微流控技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，為血液中肝素濃度的在線、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供可行的方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微透析探針可對(duì)血漿中的肝素有效采樣；微流控芯片配合熒光試劑，能夠可持續(xù)地精確測(cè)量出樣品中的肝素變化，并得到清晰的藥物濃度曲線。該微透析-微流控系統(tǒng)能顯著提高肝素檢測(cè)的時(shí)效性，將以往需要數(shù)小時(shí)的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)縮短至16 min，可精確測(cè)量0～4 IU/mL 的肝素濃度。同時(shí)，該系統(tǒng)還具有良好的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)一種新型的肝素快速分析和魚精蛋白效果評(píng)價(jià)的方法，為臨床用藥提供更清晰的視野。