雷濤，劉玉紅，張煜，梁卓文

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，陜西西安710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔科，陜西西安710032；3.聯(lián)勤保障部隊(duì)解放軍第901醫(yī)院，安徽合肥230031；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西西安710032

前言

促周圍神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘化在周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)中扮演著重要作用，而周圍神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘化過程是由多因素調(diào)節(jié)的髓鞘形成細(xì)胞-雪旺細(xì)胞（SCs）與軸突之間復(fù)雜的相互作用過程［1-3］。在腕管綜合征引起的正中神經(jīng)損傷患者術(shù)后給予電刺激治療，證實(shí)短暫低頻的電刺激治療可顯著促進(jìn)神經(jīng)再生，刺激神經(jīng)支配區(qū)域的感覺和運(yùn)動(dòng)功能，但具體機(jī)制不清楚［4-5］。因此，建立體外的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）-SCs-電刺激模型可為研究電刺激促周圍神經(jīng)成髓鞘機(jī)制提供基礎(chǔ)。

本文設(shè)計(jì)了一種電刺激細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具備組裝簡單、高透明性、可滑動(dòng)拆卸玻片的特點(diǎn)，可用于各種成像設(shè)備的觀察，無須轉(zhuǎn)移和破壞細(xì)胞。該系統(tǒng)可用于DRG-SCs-電刺激模型。

1 材料和方法

1.1 電刺激細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

電刺激細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括函數(shù)發(fā)生器（安捷倫科技公司）和電刺激小室（自制）（圖1a）。函數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生波幅為6 Vp-p、頻率為10 Hz 矩形波（圖1b）。電刺激小室從上到下共由5 個(gè)部分組成：聚苯乙烯蓋（Biologix, 中國）、中空聚苯乙烯室（Biologix, 中國）、生物相容性墊片（Biologix, 中國）、導(dǎo)電玻璃（58 mm×25 mm×1 mm, 顧洛公司,中國）和聚苯乙烯夾具（Biologix，中國）（圖1a）。中空的聚苯乙烯室被生物相容性墊圈包圍，導(dǎo)電玻璃在中空聚苯乙烯室的下方。聚苯乙烯夾具固定中空聚苯乙烯室和導(dǎo)電玻璃，防止培養(yǎng)基外流。電刺激小室可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行串聯(lián)或并聯(lián)電路。在本研究中，將3個(gè)電刺激小室用銅線和導(dǎo)電夾并聯(lián)，用于多個(gè)樣本的電刺激干預(yù)（圖2）。

圖1 電刺激細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)Fig.1 Electrical stimulation(ES)cell culture system

圖2 電刺激小室Fig.2 ES chamber

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 DRG培養(yǎng)從新生1天SD大鼠收集DRG，剪碎后加入0.5 mL膠原酶、1 mL 0.25%胰蛋白酶（不含乙二胺四乙酸）及1 mL DME/F12（HyClone,USA）消化1 h，用40 μm微孔過濾器過濾后終止消化。以500 g/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。將細(xì)胞懸浮在含有10%胎牛血清（FBS）的DME/F12培養(yǎng)基（Gibco,USA）中，然后將細(xì)胞懸液以3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在電刺激小室的導(dǎo)電玻璃上。培養(yǎng)24 h 后，更換培養(yǎng)基，用Neurobasal（Gibco,USA）+B27（Gibco, USA）+NGF（50 ng/mL）（R&D Systems,USA）+5-FU（31 μmol/mL）（HSRVEY,USA）培養(yǎng)48 h，去除非DRG細(xì)胞，在不含5-FU的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，以備實(shí)驗(yàn)使用［6］。

1.2.2 SCs培養(yǎng)從新生1 天的SD 大鼠收集雙側(cè)坐骨神經(jīng)，剪碎后置入5 mL 離心管中，隨后加入1 mL 膠原酶、1 mL 0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）和1 mL DME/F12 進(jìn)行消化。消化30 min，以500 g/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min。將細(xì)胞懸浮在含10% FBS 血清的DME/F12 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后用含5-FU（31 μmol/mL）、Forskolin（10 μmol/mL）和10%FBS血清的DME/F12 培養(yǎng)液純化48 h，再改為含F(xiàn)orskolin（10 μmol/mL）和10% FBS 血清的DME/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，以備實(shí)驗(yàn)用［6］。

1.2.3 DRG/SCs 共培養(yǎng)將SCs 用0.25%的胰蛋白酶（含EDTA），消化5 min，500 g/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min后使用含10% FBS 血清的DME/F12 培養(yǎng)液重懸，吸除導(dǎo)電玻璃培養(yǎng)板的培養(yǎng)液，將SCs 以2×105的密度接種于培養(yǎng)DRG 的電刺激小室中培養(yǎng)24 h。之后更換為Neurobasal+B27+NGF（50 ng/mL）+5%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 電刺激方案

電刺激小室在使用前經(jīng)超聲波清洗、洗滌、干燥，然后進(jìn)行紫外線照射消毒（12 h）。消毒后，用多聚賴氨酸包被導(dǎo)電玻璃表面3 h。DRG/SCs 共培養(yǎng)24 h 后分為對照（Ctrl）組和電刺激（ES）組。ES 組給予矩形波電刺激，波幅6 Vp-p，頻率10 Hz，1 h/d，7 d。Ctrl組無電刺激。Ctrl組和ES組的培養(yǎng)基每2 d更換1 次。在整個(gè)過程中，電極與培養(yǎng)基和細(xì)胞不接觸，導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電性能正常。

1.4 細(xì)胞毒性檢測

檢測導(dǎo)電玻璃培養(yǎng)系統(tǒng)是否對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，DRG/SCs 共培養(yǎng)7 d 時(shí)，ES 組和Ctrl組細(xì)胞樣品分別轉(zhuǎn)移至96孔板，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，再向每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8（CCK8）溶液，繼續(xù)培育1 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.5 免疫熒光檢測

DRG/SCs 細(xì)胞的髓鞘形成由髓磷脂堿性蛋白（MBP）的免疫熒光標(biāo)示，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)以神經(jīng)微絲蛋白200（NF200）標(biāo)示。在第7 天，將DRG/SCs 細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min?？筂BP 一抗（BIOSS, 中國）和抗NF200 一抗（Abcam, 英國）在4 ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次。避光加入羊抗鼠IgG-488(1：600)二抗、羊抗兔IgG-Cy3（1：600）二抗。用PBS 洗滌3 次后，在萊卡倒置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)下觀察細(xì)胞。隨機(jī)選擇5 個(gè)視野。用ImageJ 軟件分析熒光強(qiáng)度和面積。熒光密度由熒光強(qiáng)度除以面積得到。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。數(shù)據(jù)用SPSS 20.0.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

CCK8 細(xì)胞毒性結(jié)果顯示（圖3），ES 組的光密度（OD）值略高于Ctrl 組，但兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。因此，證實(shí)導(dǎo)電玻璃培養(yǎng)體系對神經(jīng)細(xì)胞無毒性。

圖3 7天的電刺激對DRG/SCs細(xì)胞毒性的影響Fig.3 Effects of 7-day ES on the cytotoxicity of DRG/SCs

半定量結(jié)果顯示ES組MBP熒光強(qiáng)度明顯高于Ctrl組（P<0.01）（圖4）。圖5為Ctrl組和ES組DRG/SCs細(xì)胞的MBP蛋白免疫熒光。神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)以NF200染色表示（綠色），髓鞘段以MBP染色表示（紅色）。

圖4 Ctrl組和ES組MBP熒光強(qiáng)度的半定量結(jié)果Fig.4 Semi-quantitative results of fluorescence intensity of MBP in control group and ES group

圖5 Ctrl組和ES組DRG/SCs細(xì)胞的MBP免疫熒光Fig.5 Immunofluorescence of MBP in DRG/SCs in control groups and ES groups

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文設(shè)計(jì)的電刺激細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對神經(jīng)細(xì)胞安全無毒，連續(xù)7 d 的電刺激可提高神經(jīng)髓鞘化率。

周圍神經(jīng)損傷的自愈能力有限，導(dǎo)致肌肉組織相應(yīng)萎縮，功能喪失［7-8］。電刺激可以直接促進(jìn)軸突生長，提高神經(jīng)修復(fù)的速度和成功率［9-10］。同時(shí)，電刺激可以增加SCs的活性和神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，但具體的分子機(jī)制尚不清楚［11-14］。建立一個(gè)簡單、有效、可重復(fù)的電刺激細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，對于研究神經(jīng)細(xì)胞與電流的相互作用機(jī)制，制定有效的臨床電刺激治療參數(shù)尤為重要。與以往報(bào)道的電刺激設(shè)備相比［15-17］，本研究中的電刺激培養(yǎng)系統(tǒng)組裝簡單，電極不與培養(yǎng)液和細(xì)胞接觸，不會(huì)產(chǎn)生毒性。另外，該系統(tǒng)電流均勻，高清晰度的導(dǎo)電玻璃可以滿足各種檢測成像要求。此外，通過使用串聯(lián)或并聯(lián)的電刺激室，可以滿足不同種類的實(shí)驗(yàn)需求。

4 結(jié)論

綜上所述，本文設(shè)計(jì)的電刺激培養(yǎng)系統(tǒng)組裝方便，操作簡單，價(jià)格低廉，可用于各種不同的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。該系統(tǒng)對神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)成髓鞘有明顯的刺激作用，為研究神經(jīng)與電信號的關(guān)系提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。