范義湘，易紫薇，胡煜麟，張宏嘉，林美珍，陳潔芳，肖漢

1.南方醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，廣東廣州510900；2.廣東省第二人民醫(yī)院核醫(yī)學科，廣東廣州510317

前言

肝細胞癌（HCC）是我國高發(fā)腫瘤，目前根治性切除、肝動脈栓塞化療等可以取得較好的近期療效，但復發(fā)率高、遠期療效不理想，尤其對于肝癌轉移瘤的治療更為困難［1］。鈉碘轉運體（Sodium/Iodine Symporter, NIS）是甲狀腺濾泡細胞調節(jié)碘攝入的膜蛋白通道，既往報道采用轉基因技術，使低分化或未分化甲狀腺癌等腫瘤具備攝碘功能，為腫瘤的核素靶向治療提供新思路［2］。本研究采用轉染外源性NIS 基因，上調HCC 細胞NIS 蛋白表達，使HCC 細胞具備攝碘功能，為HCC提供新的治療方法。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

總RNA 提取試劑Trizol reagent 和脂質體lipofectamine 2000、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Invitrogen 公司。RT-PCR 試劑盒、限制性內切酶EcoRI等購自Takara公司。質粒提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒等購自Omega 公司。Triton X-100 購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。Na125I為成都中核高通同位素公司生產，放射化學純度99.7%，無載體，pH 8.0。NIS 擴增片段上游引物序列為：5'-CTCCCTGCTAAACGACTCCAG-3'，下游引物序列為：5'-AACAGACGATCCCTCATTGGTG-3'，購自Invitrogen公司。人肝癌細胞株HepG2購自武漢益普生物科技有限公司。核酸蛋白分析儀為美國Beckman 公司DU-530 型，基因擴增儀為美國Perkin Elmer 公司PE-460 型，放射性γ 計數器為上海核福光電有限公司SN-682 型，流式細胞儀為美國BD FACSCanto II 型，熒光倒置顯微鏡為德國Leica DMi8型。

1.2 人肝癌細胞株HepG2培養(yǎng)

參照文獻［3］，選擇人肝癌細胞株HepG2 作為研究對象。以DMEM 為培養(yǎng)液，培養(yǎng)液均含質量分數10%的胎牛血清及100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置37 ℃、體積分數5% CO2孵箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，細胞為貼壁生長。定期采用含0.25%胰酶EDTA 溶液消化傳代。待細胞生長至對數生長期進行實驗。

1.3 PCR擴增人NIS（hNIS）基因片段測序克隆

參照既往研究方法［4］，采用Trizol 法提取人8505C 細胞總的RNA，并設計NIS 基因的1 對引物。以逆轉錄合成的DNA 為模板進行PCR 擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段并用T4DNA 連接酶將其直接與克隆載體pUCmT 連接，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌XL Blue。將含有正確hNIS 序列的重組質粒pUCmThNIS 及真核載體pcDNA3經HindⅢ和XbaI雙酶切、連接、轉化，得到重組質粒pcDNA3/hNIS。

1.4 體外NIS轉染

在6 孔培養(yǎng)板中接種處于對數生長期的肝癌細胞HepG2，每孔細胞數約為5×105。以上述相同方法培養(yǎng)并觀察細胞生長情況，待生長密度達到90%以上時，采用電轉染法進行轉染。轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對照組細胞不轉染NIS基因。

1.5 Western-Blot法測定NIS基因表達

實驗組和對照組細胞，去培養(yǎng)上清液，用PBS液洗滌細胞2次，加入預冷的細胞裂解液150 μL，以細胞刮將細胞刮取，收集到細胞離心管，冰浴20 min后于4 ℃、12 000 g離心15 min，收集上清液。瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后照相。Kodak Digital Science ID軟件系統(tǒng)掃描分析，測定光密度值并計算NIS/GAPDH光密度比值［5］。其結果為3次重復實驗結果。

1.6 細胞攝碘率測定

按以往研究方法［6］，于轉染后24 h，將實驗組和對照組細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板，每孔約1×105，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)至細胞約80%融合時吸掉培養(yǎng)液，Hanks平衡鹽溶液（HBBS）洗滌1次，以微量加樣器（0～50 μL）加入含Na125I 13.7 kBq（0.37 μCi）的培養(yǎng)液，37 ℃溫育搖床振蕩24 h。收集細胞置入測量管，用放射性γ 計數器測量每分鐘放射性計數（T），之后離心去上清液，細胞沉淀用HBBS洗滌2 次，離心去上清液，測定結合于細胞的每分鐘放射性計數（B）。對照組和NIS 轉染組細胞攝碘率以B/T%表示，每組細胞設置3個重復樣品。

1.7 DAPI染色檢測HepG2細胞凋亡

取上述培養(yǎng)后消化的HepG2 細胞，制成細胞懸液，接種于24 孔細胞培養(yǎng)板，每孔約1×105，加入含Na125I 13.7 kBq（0.37 μCi）的培養(yǎng)液，37 ℃溫育搖床振蕩24 h。收集細胞置入測量管，置于6 孔培養(yǎng)板，每孔約1×106，培養(yǎng)72 h 后以PBS 液洗滌細胞2 次，以4%多聚甲醛在4 ℃固定細胞30 min，固定過的細胞再以PBS 洗滌2 次，然后以含0.1% Triton X-100 的0.1%檸檬酸鈉溶液于4 ℃孵育細胞5 min，加入DAPI于4 ℃暗箱孵育10 min，360 nm紫外線激活，熒光顯微鏡觀察細胞染色。計數每個高倍鏡（×400）下熒光染色細胞數及細胞總數，以前者除以后者為凋亡率。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗比較實驗組與對照組之間的差異性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 轉染后HepG2細胞NIS表達測定

實驗組NIS 蛋白電泳條帶粗濃、寬厚，對照組條帶細小、稀疏（圖1），NIS/GAPDH 光密度比值在實驗組平均值為0.49±0.12，對照組為0.18±0.11。經比較，實驗組HepG2 細胞NIS 表達強度顯著高于對照組（t=2.693,P<0.05），說明經NIS 基因轉染后實驗組HepG2細胞已表達NIS蛋白。

圖1 HepG2細胞NIS蛋白表達的Western-Blot檢測結果Fig.1 NIS protein expression in HepG2 cells was detected by Western-Blot assay

2.2 HepG2細胞攝碘率比較

培養(yǎng)板每孔細胞加入的Na125I經γ計數器測量，其放射性總計數T（Total,T）為89 720 CPM（counts/min）。實驗組HepG2 細胞所攝取的Na125I 放射性計數B（Binding, B）平均為（16 528±5 200）CMP，經計算其攝碘率B/T%平均為（18.4±5.8）%。對照組HepG2細胞所攝取的Na125I放射性計數B平均為（1 820±1 610）CPM，經計算攝碘率B/T%為（1.9±1.8）%。兩者比較具有顯著性差異（t=36.842,P<0.05），即經NIS基因轉染后，實驗組HepG2細胞攝碘率顯著提高。

2.3 細胞凋亡測定

HepG2細胞經DAPI染色后鏡下呈藍白色熒光。凋亡細胞呈核濃縮，染色加深，或者核染色質呈新月形聚集于核膜一側。有些細胞表現為核碎裂呈大小不等的圓形小體，被細胞膜包繞，形成凋亡小體。實驗組具有凋亡特征的染色細胞數多于對照組（圖2）。細胞經稀釋并調整細胞濃度后，顯微鏡下每個高倍視野內（×400）細胞數約70個，實驗組含有核凋亡特征的細胞數為10～14個，實驗組凋亡率平均為（19.2±5.3）%，對照組高倍視野下凋亡細胞數為2～5個，凋亡率為（5.8±3.1）%，顯著低于實驗組（t=3.086,P<0.05）。

圖2 NIS表達對HepG2細胞攝碘-125后細胞凋亡的影響（×400）Fig.2 Effects of NIS protein expression on apoptosis of HepG2 cell after iodine-125 uptake(×400)

3 討論

HCC是世界5大最常見腫瘤之一，占中國癌癥發(fā)病率第2 位和病死率的第1 位，在亞洲的一些地區(qū)，HCC是癌癥死亡最常見的原因［1,7］。

NIS是一種介導碘轉運的糖化膜蛋白，即所謂的“碘泵”，主要位于甲狀腺細胞基底膜，其功能主要是借助鈉/鉀交換產生的鈉離子濃度梯度，逆濃度轉運血液內活性碘進入細胞，從而可使細胞內碘含量為血漿的20～200倍［8］。它實現了甲狀腺組織攝取碘并進行甲狀腺激素的生物合成，實現了甲狀腺功能亢進和分化型甲狀腺癌的顯像診斷和放射性碘治療。因此，NIS是細胞濃聚碘并進行放射性碘治療的基礎［9］。1996年有學者首先從FPTL-5細胞的cDNA文庫克隆出鼠NIS基因［10］，隨后另有學者采用針對鼠NIS cDNA序列的引物，經逆轉錄-聚合酶鏈反應法擴增出hNIS的細胞cNDA片段，并從人甲狀腺細胞cNDA文庫中克隆出hNIS。hNIS基因位于19號染色體，整個編碼區(qū)由15個外顯子和14個內含子構成，其開放閱讀框架為1 929個核苷酸，編碼643個氨基酸殘基［10-11］。隨著NIS結果和功能的闡明，采用提取hNIS mRNA，以此為起始原料經逆轉錄產生cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，將得到的NIS基因克隆到含有巨細胞病毒啟動子，再將擴增的質粒DNA轉染腫瘤細胞，誘導細胞NIS基因表達，這對于不表達NIS的HCC等惡性腫瘤，為實施放射性治療提供了實驗基礎和新思路［12］。隨著基因轉染方法的應用，使不表達NIS的腫瘤具備攝碘功能，如失分化甲狀腺癌、未分化甲狀腺癌、乳腺癌、膠質瘤、肺癌等，具備攝碘功能而實施放射性內照射治療［12-15］。有研究發(fā)現用hNIS基因轉染無攝碘功能的鼠甲狀腺癌細胞，其攝碘能力提高了60倍，從而為難治性腫瘤的放射性碘治療開辟了新思路［16］。本研究將NIS基因穩(wěn)定轉染至原發(fā)性肝癌細胞HepG2細胞，經Western-Blot方法檢測出轉染的細胞具備NIS蛋白表達，而未轉染細胞內沒有NIS表達。因為轉染后細胞具備了NIS蛋白通道，從而具有攝碘功能，其平均攝碘能力達18.4%，為未轉染組的9.6倍，與目前類似研究結果接近［15］。因此，我們認為HCC細胞表達NIS基因和蛋白，并具備攝碘能力，是基因轉染的結果。放射線可引起腫瘤細胞凋亡［3,16］。本研究轉染組細胞因為攝取125I引起細胞改變，靶向為細胞呈核濃縮，染色加深，或者核染色質呈新月形聚集于核膜一側，有些細胞甚至出現核碎裂，形成凋亡小體［17-18］。而未轉染NIS的對照組具有凋亡特征的染色細胞數較少。

綜上所述，本研究通過轉染NIS 基因，使HCC 細胞具備攝碘功能，放射性碘引起細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，為下一步體內實驗奠定了理論基礎。