張星星，黃 新，韓猛立，蔣烈戈，張 倩，高 攀，劉 鵬，吳桐忠，鐘發(fā)剛

(1.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所新疆石河子 832000;2.新疆生產(chǎn)建設兵團第九師農(nóng)業(yè)(畜牧)科學研究所，新疆額敏 834600)

0 引 言

【研究意義】夏洛萊牛生長快、肉量多、體型大、耐粗放[1]。中國的夏洛萊牛主要分布在遼寧、河南和新疆塔城地區(qū)，其中新疆塔城是中國最早引入夏洛萊牛的地區(qū)，目前有舍飼和放牧2種飼養(yǎng)方式，放牧的夏洛萊牛主要在準噶爾盆地塔城-額敏盆地周緣諸山地的天然草地上放牧，天然草地類型分布從平原至高山分別是溫性荒漠類、溫性草原化荒漠類、溫性荒漠草原類、溫性草原類、溫性草旬草原類和山地草旬類，草地整體草群質(zhì)量較好，優(yōu)良牧草種類多，主要以禾本科草和雜草類為主[2]。腸道作為微生物大量存在的棲息地，不僅形成了復雜的腸道微生態(tài)系統(tǒng)[3]，而且作為宿主生命活動的有機組成部分，對宿主的生長發(fā)育具有重要的影響[4,5]，腸道微生物與生物體物質(zhì)代謝、能量流動、信號傳導等有重要的調(diào)控作用，并且對動物的飲食、營養(yǎng)、免疫、神經(jīng)調(diào)節(jié)以及慢性疾病的產(chǎn)生有重要的影響?！厩叭搜芯窟M展】健康平衡的腸道菌群的結構會促進生物體的生長發(fā)育，失衡的腸道菌群則會因為對生物體的調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂。對腸道微生物進行深入細致的研究是理解各種慢性疾病及免疫與病原微生物疾病發(fā)生機理的重要的方式方法，并且可以對生物體在不同生境分布下的適應性機制有更深刻的理解和把握[9]。【本研究切入點】隨著高通量測序技術的逐漸發(fā)展，16S rRNA在微生物基因組的研究作用中受到越來越多的重視[13]，其具有無需分離培養(yǎng)細菌、客觀還原菌群結構和測序深度高等優(yōu)勢[14]。研究高通量測序技術比較放牧與舍飼條件下，夏洛萊牛腸道微生物多樣性及差異。【擬解決的關鍵問題】以塔城地區(qū)夏洛萊牛為對象，采用HiSeq高通量測序技術，研究放牧夏洛萊牛和舍飼夏洛萊牛腸道菌群多樣性及菌群結構差異。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗牛場為規(guī)?；犸暼馀ｐB(yǎng)殖場和放牧肉牛養(yǎng)殖場，位于新疆塔城地區(qū)，2017年9月，選取舍飼的健康夏洛萊青年牛和自然放牧飼養(yǎng)的健康夏洛萊青年牛各5頭牛作為試驗牛，采集試驗牛直腸糞便牛裝入無菌封口聚乙烯袋做好標記，帶回實驗室。全放牧夏洛萊牛飼料為天然牧草(以禾本科草和雜類草為主)，舍飼牛飼料(精料∶干草∶青儲飼料=1∶1∶5，干草為禾草飼草，精料原料為玉米、棉籽粕等)。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取與檢測

使用糞便基因組提取試劑盒(TIANamp Stool DNA Kit)(天根DP328，中國)按照試劑盒說明書提取牛糞便樣品中基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性，使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(Thermo Scientific)檢測DNA樣品的濃度與純度。

1.2.2 PCR擴增與產(chǎn)物純化

將提取糞便總DNA送至北京諾禾致源科技有限公司，應用Illumina HiSeq平臺對細菌16SrRNA基因的V3+V4區(qū)域(341F-806R)進行擴增，引物序列為341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT，高效和高保真酶進行PCR 擴增，反應體系參照說明書，反應條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.3 DNA提取與檢測

使用糞便基因組提取試劑盒(TIANamp Stool DNA Kit)(天根DP328，中國)按照試劑盒說明書提取牛糞便樣品中基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性，使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(Thermo Scientific)檢測DNA樣品的濃度與純度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對Illumina HiSeq測序的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)進行拼接的質(zhì)控，并過濾掉低質(zhì)量的序列，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)?；谟行?shù)據(jù)進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析；根據(jù)OTUs聚類結果，對每個OTU的代表序列做物種注釋，揭示樣品物種構成及豐度分布情況；對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算、Venn圖和花瓣圖分析，得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同分組間的共有和特有OTUs信息；對OTUs進行多序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)生樹，通過PCoA和PCA和樣品聚類樹展示不同分組的群落結構差異；用LEfSe和MetaStat統(tǒng)計分析方法對分組樣品的物種組成和群落結構進行差異顯著性檢驗，P<0.05被認為差異顯著，P<0.01被認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 樣品測序及取樣深度驗證

研究表明，各個樣品在不同OTU中的豐度信息，10個樣品共聚類為1 089個OUT，其中舍飼夏洛萊牛組1 044個OTU，放牧夏洛萊牛組1 087個OTU，平均測序讀長在410～411 kb。表1

表1 10個樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Sequencing data statistics of 10 samples

序列數(shù)量到3 000以后各樣品稀釋曲線均基本趨于平緩，此糞便樣品中的物種并不會隨測序數(shù)量的增加而顯著增多。圖1

圖1 相似度為0.97 條件下各糞便樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of each stool sample at cutoff level of 3%

2.2 各樣品中細菌多樣性及相關性

研究表明，Chao1和Shannon指數(shù)在放牧夏洛萊牛樣品中的平均值分別為1 049.57和5.44，而在舍飼夏洛萊牛樣品中分別為997.23和5.39，放牧夏洛萊牛腸道中細菌多樣性和豐度均高于舍飼夏洛萊牛。表2

表2 各樣品細菌多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of bacteria in each sample

在97%的相似度水平下，得到了每個樣品的OTU個數(shù)，利用R Version2.15.3軟件繪出CB組和CG組的Venn圖[17]，可以展示樣品或組之間共有、特有OTU數(shù)目，直觀的表現(xiàn)出樣品間OTU的重合情況。結合OTU所代表的物種，可以找出不同環(huán)境中的核心微生物。10個樣品共聚類為1 089個OUT，其中CB組CG組共同占有1 042個OTU，CG組特有OUT為45個，占樣品總OTU數(shù)1 089的4.13%，而CB組特有OUT占樣品總OTU數(shù)的0.18%。圖2

注：CB.舍飼夏洛萊牛；CG.放牧夏洛萊牛Note:CB.barn feeding Charolais；CG.grazing Charolais圖2 2組樣品中OTUs分布韋恩圖Fig.2 Venn figure of OTUs distribution of two group samples

2.3 樣品群落組成

2.3.1 細菌門水平分布

研究表明，CB組有3個優(yōu)勢菌門(含量>1%)，CG組有2個優(yōu)勢菌門，厚壁菌門(Firmicutes，CB 69.3%，CG 73.8%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，CB 27.3%，CG 22.7%)在2組中均為優(yōu)勢菌門，其次為疣微菌門(Verrucomicrobia，CB 1.27%，CG 0.96%)、放線菌(Actinobacteria，CB 0.35%，CG 0.83%)、廣古菌門(Euryarchaeota，CB 0.73%，CG 0.21%)、變形菌門(Proteobacteria，CB 0.26%，CG 0.41%)、藍細菌門(Cyanobacteria，CB 0.16%，CG 0.25%)、螺旋菌門(Spirochaetae，CB 0.197%，CG 0.072%)、軟壁菌門(Tenericutes，CB 0.089%，CG 0.131%)、Saccharibacteria門(Bacteroidetes，CB 0.029%，CG 0.122%)、纖維桿菌門(Fibrobacteres，CB 0.003%，CG 0.052%)、梭桿菌門(Fusobacteria，CB 0.027%，CG 0.015%)、Others(CB 0.003%，CG 0.052%)。CG組厚壁菌門與擬桿菌門的比值(3.25)高于CB組(2.54)。圖3

注：圖中分別是CB組和CG組的細菌門分類豐度(A)和2組中每個樣的細菌門分類的豐度(B).其中Y 軸表示百分比含量；X 軸分別表示2組樣及每個樣本.菌門信息根據(jù)中間圖例進行顏色編碼Note:The figure shows the dominant phyla abundance of CB and CG groups and the dominant phyla abundance of each sample in two different groups.Y-axis represents the percentage of the content,and X-axis represents the saliva sample between two groups and each subject.The phyla information is color-coded according to the legend in the middle圖3 CB 及CG 組細菌門分類水平的比較Fig.3 Comparison of bacteria groups at phylum level between CB and CG

2.3.2 細菌的科水平分布

研究表明，CB組有11個優(yōu)勢菌科，CG組有9個優(yōu)勢菌科，依次為瘤胃球菌科(Ruminococcaceae，CB 41.87%，CG 50.20%)、理研菌科(Rikenellaceae，CB 13.80%，CG 10.04%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，CB 10.14%，CG 8.90%)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae，CB 8.99%，CG 4.01%)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae，CB 4.65%，CG 4.75%)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae，CB 3.49%，CG 5.03%)、擬桿菌科(Bacteroidaceae，CB 3.69%，CG 3.84%)、Family_XIII科(Family_XIII，CB 0.96%，CG 2.93%)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae，CB 1.26%，CG 0.95%)、p-2534-18B5_gut科(p-2534-18B5_gut_group，CB 1.02%，CG 1.12%)、擬桿菌目S24-7科(Bacteroidales_S24-7_group，CB 1.27%，CG 0.75%)、梭菌科(Clostridiaceae_1，CB 1.79%，CG 0.19%)、Others(CB 0.003%，CG 0.052%)。圖4

注：圖中分別是CB組和CG組的細菌科分類豐度(A)和2組中每個樣的細菌科分類的豐度(B).其中Y 軸表示百分比含量；X 軸分別表示2組樣及每個樣本.菌門信息根據(jù)中間圖例進行顏色編碼Note:The figure shows the dominant family abundance of CB and CG groups and the dominant family abundance of each sample in two different groups.Y-axis represents the percentage of the content,and X-axis represents the saliva sample between two groups and each subject.The family information is color-coded according to the legend in the middle圖4 CB 及CG 組細菌科分類水平的比較Fig.4 Comparison of bacteria groups at family level between CB and CG

2.4 多樣品比較

2.4.1 樣品主成分和主坐標

研究表明，CB組的樣品和CG組的樣品依據(jù)所處組別而相互聚類到一起，表明CB組和CG組的組內(nèi)相似性比組間相似性高，也說明CB組和CG組的菌群多樣性存在差異。圖5，圖6

圖5 Beta 多樣性的主成分分析(PCA)Fig.5 Principal Component Analysis(PCA)scores plot of beta diversity

圖6 Beta 多樣性的主坐標分析(PCoA)Fig.6 Principal coordinate analysis(PCoA)scores plot of beta diversity

2.4.2 樣品聚類分析

為了進一步研究不同樣品間的相似性，結合樣品間物種組成的相似性和細菌豐度的相似性，構建了UPGMA聚類樹與柱狀圖結合圖，左下方圖注顏色代表聚類樹樣品所在分組的顏色，右上方圖注代按屬水平細菌豐度排名前10的細菌，其他歸為Others，未注釋到的物種歸為Unclassified。其中左圖為樣品聚類樹，通過Python語言工具對樣品進行層次聚類，用以判斷各樣品間物種組成的相似性，樣品越靠近，枝長越短，說明兩個樣品的細菌組成越相似；右圖為各樣品屬水平的豐度柱狀圖，用以判斷各樣品間細菌豐度的相似性，根據(jù)各色塊所占比例比較各樣品的物種多樣性高低、豐度相似性以及優(yōu)勢物種。結果與PCA的分析結果類似，CB組5個樣品和CG組5個樣品各自被聚為一支。圖7

圖7 樣品聚類樹柱狀組合圖Fig.7 Clustering tree and histogram combined graph of samples

2.5 組間物種差異

2.5.1 組間樣品LEfSe

利用LEfSe[18](Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size)方法尋找2組間具有統(tǒng)計學差異的物種。以默認的LDA Score值4為標準，將大于此值的物種作為Biomarker(生物標識)，LDA柱形圖長度越長代表差異物種對組間差異性的影響越大。在物種系統(tǒng)發(fā)育關系樹中將Biomarker展示出來，其顏色由其對所在組產(chǎn)生重要影響最大的組的顏色決定。LDA值分布柱狀圖顯示CB組中擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、理研菌科(Rikenellaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、Paeni梭菌屬(Paeniclostridium)豐度顯著高于CG組，CG組中厚壁菌門(Firmicutes)、(Ruminococcaceae)瘤胃球菌科的豐度顯著高于CB組。圖8

圖8 LDA值Fig.8 Histogram of LDA score

2.5.2 組間樣品Metastats

由于舍飼夏洛萊牛和放牧夏洛萊牛糞便的一些細菌類群的豐度差異較大。為了研究2組樣品間細菌群落豐度的差異，利用Metastats[19]軟件對組間的物種豐度數(shù)據(jù)進行T-test；得到P值，根據(jù)P<0.05篩選出導致2組樣品組成差異的物種。2組樣品中不同分類水平相對豐度較高且差異顯著的菌群，在門水平，舍飼夏洛萊牛組中的擬桿菌門(Bacteroidetes)和螺旋體門(Spirochaetae)相對豐度顯著高于放牧夏洛萊牛；舍飼夏洛萊牛組中的厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、Saccharibacteria門、纖維桿菌門(Fibrobacteres)相對豐度顯著低于放牧夏洛萊牛；在屬水平，放牧夏洛萊牛組中的Ruminococcaceae_UCG-005、Christensenellaceae_R-7_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Prevotellaceae_UCG-004、Roseburia相對豐度顯著高于舍飼夏洛萊牛；舍飼夏洛萊牛組中的Rikenellaceae_RC9_gut_group、Peptoclostridium、Paeniclostridium、Alistipes、Lachnospiraceae_UCG-008、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Clostridium_sensu_stricto_1、Cellulosilyticum相對豐度顯著高于放牧夏洛萊牛。表3

表3 2組樣品中不同分類水平相對豐度較高且差異顯著的菌群Table 3 The relative abundance of family in the two sample group

續(xù)表3 2組樣品中不同分類水平相對豐度較高且差異顯著的菌群Table 3 The relative abundance of family in the two sample group

3 討 論

10個樣品共獲得有效序列的總數(shù)為683 814，平均測序讀長在410～411 kb。在97%的相似度水平下共產(chǎn)生有效OTU個數(shù)為1 089，涵蓋了12門24綱33目57科170屬的細菌。從整體來看，舍飼夏洛萊牛(6 000個左右序列共屬于1 044個OTUs)，放牧夏洛萊牛(6 000個左右序列共屬于1 087個OTUs)，研究結果比周珊[20]報道的錦江黃牛糞便的細菌多樣性(20 000多個16S rRNA基因序列分屬于669個OTUs)更豐富多樣，也說明不管舍飼夏洛萊牛還是放牧夏洛萊牛糞便微生物都非常豐富。且放牧夏洛萊牛樣品中Chao1和Shannon指數(shù)(1 049.57，5.44)均高于舍飼夏洛萊牛(997.23，5.39)，放牧夏洛萊牛腸道中細菌多樣性和豐度均高于舍飼夏洛萊牛，這可能和夏洛萊牛日糧結構、生活環(huán)境以及環(huán)境中的共生微生物之間的群體效應等因素有關[16]。

通過與RDP數(shù)據(jù)庫[21]進行比對，放牧夏洛萊牛與舍飼夏洛萊牛的腸道細菌按豐度排在前2名的都是厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，且厚壁菌門在所有樣本中豐度占比均在60%以上，占絕對優(yōu)勢。厚壁菌門和擬桿菌門豐度占比之和均在90%以上。在屬水平上，有3%～4%未分類細菌，這說明夏洛萊牛糞便樣品中還蘊含著部分人類未知的微生物種類。以往的研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門在很多草食動物(錦江黃牛、荷斯坦牛、喜馬拉雅塔爾羊、巖羊、歐洲盤羊)瘤胃和腸道微生物中均為優(yōu)勢菌門[9,11,12,20]，這與研究結果一致。也說明采用直腸糞便探討夏洛萊牛腸道菌群結構和功能是可行的。

在反芻動物中，后腸道約占總消化道的17%，其為整個機體提供了5%～30%的能量[22]，說明后腸道菌群在一定程度上可以反映宿主的能量利用效率。以往研究表明，反芻動物的能量代謝效率主要受飼糧精粗比、飼草種類、飼料添加劑等因素的影響[23-24]，其腸道中厚壁菌門的相對豐度與飼糧中干草含量呈顯著正相關[25,26]，且擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)在很多草食動物胃腸道微生物中均為優(yōu)勢菌門[27-29]。研究結果顯示，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為夏洛萊牛腸道優(yōu)勢菌門，并且放牧夏洛萊牛腸道中厚壁菌門(73.8%)顯著高于舍飼夏洛萊牛(69.3%)。研究中，放牧夏洛萊牛日糧主要由牧草組成。

牛瘤胃與腸道中的微生態(tài)系統(tǒng)可以幫助宿主消化動物體自身難以利用的粗纖維(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素)，從大量的低營養(yǎng)的植物纖維中攝取所需的能量[22]；前人研究表明，Ruminococcaceae科中的微生物能消化復雜的植物材料并產(chǎn)生丁酸鹽，丁酸是一種對結腸細胞健康至關重要的短鏈脂肪酸[30]；瘤胃球菌屬(Ruminococcaceaesp.)所含的白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌能分泌大量的纖維素酶和半纖維素酶，是反芻動物主要的纖維降解菌[31]。此外，梭狀芽孢菌科(Clostridiaceae)中的一些菌株是動物和人類主要的病原體[32]，Paeniclostridium屬和Peptoclostridium屬的一些菌株能引起人和動物的感染[33,34]；研究表明，放牧夏洛萊牛腸道Firmicutes類所占比例(73.8%)比舍飼夏洛萊牛腸道Firmicutes類所占比例(69.3%)高，舍飼夏洛萊牛腸道Bacteroidetes類所占比例(27.3%)比放牧夏洛萊牛腸道Bacteroidetes類所占比例(22.7%)高，放牧夏洛萊牛的厚壁菌門與擬桿菌門的比值(CG 3.25，CB 2.54)、梭菌科(Coriobacteriaceae)的豐度(CG 0.76%，CB 0.28%)和瘤胃球菌科豐度(CG 52.2%，CB 41.9%)顯著高于舍飼夏洛萊牛(<0.01)，放牧夏洛萊牛的Paeniclostridium屬和Peptoclostridium屬顯著低于舍飼夏洛萊牛(<0.05)，放牧夏洛萊牛具有比舍飼夏洛萊牛具有更強的消化纖維素、半纖維素的能力，且腸道微生物菌群相對更健康，因此，更適應放牧以及低能量的粗纖維的進食環(huán)境。

4 結 論

4.1舍飼夏洛萊牛和放牧夏洛萊牛腸道微生物都涵蓋了12門24綱33目57科170屬的細菌。

4.2在門水平上的優(yōu)勢菌群都為厚壁菌門和擬桿菌門，在科水平上的優(yōu)勢菌都為瘤胃球菌科、理研菌科、毛螺菌科、消化鏈球菌科和普雷沃氏菌科。

4.3舍飼夏洛萊牛和放牧夏洛萊牛腸道微生物結構與組成存在顯著性差異，且放牧夏洛萊牛腸道中細菌多樣性高于舍飼夏洛萊牛。

4.4舍飼夏洛萊牛腸道中擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目、理研菌科、消化鏈球菌科豐度顯著高于放牧夏洛萊牛，放牧夏洛萊牛腸道中厚壁菌門、瘤胃球菌科的豐度顯著高于舍飼夏洛萊牛，且放牧夏洛萊牛腸道中細菌多樣性和豐度均高于舍飼夏洛萊牛；放牧夏洛萊牛具有更強的纖維素消化能力。