麻正輝，蘇 悅，馬 雪，羊 河，侯國輝，陳柄潤，韓 旭，姚永生

(塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院/南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】棉蚜(Aphisgossypii)和棉長管蚜(Acyrthosiphomgossypii)在新疆植棉區(qū)共存發(fā)生[1]，棉蚜取食造成葉片皺縮、植株矮化，又分泌蜜露引發(fā)霉菌危害，影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，棉長管蚜無群集習性，田間種群密度相對較低，對棉花一般不構(gòu)成為害影響。棉長管蚜是棉花苗期發(fā)生的優(yōu)勢種，棉蚜為棉花現(xiàn)蕾期后的優(yōu)勢種，利用棉田早期的棉長管蚜培養(yǎng)天敵，可有效抑制棉花中后期棉蚜的發(fā)生與為害[2-6]。棉蚜在棉花苗期發(fā)生為害，已成為棉花整個生育期的蚜蟲優(yōu)勢種群和新疆棉田的主要防治對象，殺蟲劑施用劑量和頻率越來越高[7]。新煙堿類殺蟲劑噻蟲嗪是棉田常用農(nóng)藥，分析噻蟲嗪包衣對棉蚜和棉長管蚜解毒酶活性的影響，對研究棉田害蟲演替和蚜蟲綜合治理具有重要意義。【前人研究進展】乙酰膽堿酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)、細胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是昆蟲克服毒害物質(zhì)的重要酶系，在昆蟲體內(nèi)能夠參與或幫助代謝分解毒害物質(zhì)，使昆蟲對農(nóng)藥產(chǎn)生抗性[8-9]。研究表明，AChE在棉蚜對有機磷、氨基甲酸酯類殺蟲劑的抗性中發(fā)揮主導(dǎo)作用[10]，CarE表達量的增加與棉蚜對有機磷抗性的增強有關(guān)[11]。武永強等[12]研究結(jié)果表明，CYP450是棉蚜對噻蟲嗪產(chǎn)生抗性的主要因素，Wei等[13]也認為棉蚜對噻蟲嗪產(chǎn)生抗性是CYP450與酯酶的共同作用。藥劑處理昆蟲后CarE活性顯著上升[14,15]。噻蟲嗪抑制昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體使昆蟲癱瘓死亡，既可以葉面噴霧，也可以用于種子處理，對棉花苗期蚜蟲有較好的防效[16,17]。【本研究切入點】取食噻蟲嗪包衣處理棉花后，棉蚜和棉長管蚜解毒酶活性的變化未見報道。測定棉蚜和棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后解毒酶活性變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】使用2、4 g/kg噻蟲嗪包衣棉花，三葉期時采用生化方法測定取食0、2、6、12、24 h后棉蚜和棉長管蚜體內(nèi)解毒酶的活性變化，分析棉蚜和棉長管蚜對藥劑包衣棉花的適應(yīng)能力，為防控棉田蚜蟲危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試蟲源

棉蚜、棉長管蚜均采自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第一師12團11連試驗田(E 81°33'，N 40°48')，于室內(nèi)人工氣候箱(RTOP-260Y)用棉苗連續(xù)飼養(yǎng)2～3代作為蟲源，棉花品種為新陸中68號，飼養(yǎng)飼養(yǎng)溫度(23±1)℃，相對濕度60%±10%，光周期L∶D=14∶10。

棉種包衣劑量設(shè)0(CK)、2和4 g/kg 3種處理，種子包衣后于陰涼通風處自然陰干封存。2020年4月10日于塔里木大學(xué)農(nóng)學(xué)試驗站覆膜直播，品種為新陸中78號。

1.1.2 供試藥劑及主要儀器

70%噻蟲嗪種子處理可分散粉劑，瑞士先正達作物保護有限公司；羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和細胞色素P450(CYP450)及BCA蛋白定量試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。SCIENTZ-48型高通量組織研磨器(寧波新芝科技股份有限公司)；Fresco 21微量冷凍離心機和Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.2 方 法

待棉花長至三葉期，選取長勢健康的棉株清理，挑選大小一致的健康成蚜饑餓2 h后，進行接種試驗，試驗期間用籠網(wǎng)(30×30×50(cm)，200目紗網(wǎng))籠罩。

分別于接種前(記作0 h)及接種后2、6、12、24 h，在受試棉蚜和棉長管蚜中各挑選20頭無翅成蟲，加入1 mL PBS(0.066 mol/L、pH 7.4)冰浴勻漿后離心(4℃，1 200 g，30 min)，取上清得到酶粗提液。離心參數(shù)：AchE、CarE(4℃，1 500 g，30 min)；CYP450、GSTs(4℃，10 000 g，20 min)；測定參照試劑盒，根據(jù)制作的標準曲線和酶原蛋白含量的測定結(jié)果，計算酶比活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25數(shù)據(jù)處理，差異顯著性分析使用Duncan氏多重比較法；繪圖使用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后解毒酶活性變化

2.1.1 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后AChE活性變化

研究表明，2 g/kg劑量處理后AChE活性在2 h時增加9.20%，隨后在6、12、24 h分別降低9.10%、28.23%、33.79%，除24 h外，各時間點較前一時間點活性降低水平均顯著。4 g/kg劑量處理后2、6、12、24 h分別降低34.01%、51.82%、63.48%、64.68%。2 g/kg劑量處理后2 h活性高于CK，其余各時間點均低于CK且高于4 g/kg處理。棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，低劑量2 h(短時)對AChE活性有顯著的誘導(dǎo)作用，但隨時間增加表現(xiàn)為抑制作用，而4 g/kg劑量處理后活性持續(xù)降低。圖1

注：不同小寫字母表示棉蚜解毒酶活性差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicated that the detoxification enzyme activity of Aphis gossypii was significantly different(P <0.05),the same as below圖1 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉蚜AChE活性變化Fig.1 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on AChE of Aphis gossypii

2.1.2 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后CarE活性變化

研究表明，棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，2 g/kg劑量處理活性先上升后下降，12 h時顯著高于其它時間點，并高于CK，24 h較12 h降低43.02%。4 g/kg劑量處理后持續(xù)下降，在不同時間點分別下降18.41%、29.26%、42.43%、53.01%，且始終低于CK。圖2

圖2 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉蚜CarE活性變化Fig.2 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CarE of Aphis gossypii

2.1.3 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后CYP450活性變化

研究表明，棉蚜CYP450活性的影響隨時間增加最終表現(xiàn)為低劑量的誘導(dǎo)作用和高劑量的顯著抑制作用。4 g/kg處理在0 h時活性最大，2 h時活性顯著下降，隨著時間的繼續(xù)增加略有波動，但不同時間點間無顯著關(guān)系。2 g/kg處理在2 h、6 h較0 h活性分別提高20.35%、31.48%，各時間點間差異顯著，隨后下降，但仍顯著高于0 h。圖3

圖3 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉蚜CYP450活性變化Fig.3 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CYP450 of Aphis gossypii

2.1.4 棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后GSTs活性變化

研究表明，棉蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，低劑量6 h對GSTs有顯著的持續(xù)誘導(dǎo)作用，高劑量則為顯著的持續(xù)抑制作用。2 g/kg劑量處理6 h內(nèi)活性顯著持續(xù)上升，較0 h、2 h分別增加17.35%、30.09%，隨后活性顯著下降，較6 h分別降低23.99%、51.77%。4 g/kg處后，隨著時間增加活性顯著下降，較0 h分別降低10.96%、29.40%、39.49%、47.74%。圖4

圖4 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉蚜GSTs活性變化Fig.4 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on GSTs of Aphis gossypii

2.2 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后解毒酶活性變化

2.2.1 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后AChE活性變化

研究表明，棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，2和4 g/kg處理AChE活性均表現(xiàn)為持續(xù)下降，在2 h時，2 g/kg處理高出CK 2.97%，其它時間均低于CK。4 g/kg處理在2～24 h各時間點活性分別下降31.60%、46.38%、51.41%、59.41%，與其它處理相比活性始終最低。圖5

圖5 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉長管蚜AChE活性變化Fig.5 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on AChE of Acyrthosiphon gossypii

2.2.2 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后CarE活性變化

研究表明，棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣處理棉花后，低劑量短時(6 h)對CarE活性有顯著誘導(dǎo)作用，高劑量則為持續(xù)抑制作用。噻蟲嗪2 g/kg處理在2 h、6 h分別較0 h提高25.77%、42.95%，隨后在12 h、24 h較6 h降低25.46%、51.53%。4 g/kg在6、12、24 h較2 h分別下降20.85%、29.52%、40.39%，且各時間點間差異顯著。圖6

圖6 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉長管蚜CarE活性變化Fig.6 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CarE of Acyrthosiphon gossypii

2.2.3 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后CYP450活性變化

研究表明，棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后，2 g/kg處理活性在2 h達到最大，較0 h顯著提升7.45%，其它時間點間無顯著變化。4 g/kg處理活性在6 h達到最大，較2 h提高10.37%，2處理12～24 h對CYP450活性均無明顯影響。圖7

圖7 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉長管蚜CYP450活性變化Fig.7 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on CYP450 of Acyrthosiphon gossypii

2.2.4 棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后GSTs活性變化

研究表明，棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣處理棉花后，2 g/kg處理GSTs活性先升后降，12 h內(nèi)各時間點無顯著差異，24 h較0 h降低61.86%，且顯著低于其它時間點。4 g/kg處理活性持續(xù)降低，2～24 h內(nèi)各時間點較0 h分別下降30.10%、41.41%、49.72%、61.87%，各處理間均有顯著差異。低劑量處理對GSTs活性短時(6 h)呈現(xiàn)有誘導(dǎo)作用，高劑量處理有持續(xù)抑制作用。圖8

圖8 不同噻蟲嗪包衣棉花下棉長管蚜GSTs活性變化Fig.8 Effect of thiamethoxam seed dressing cotton on GSTs of Acyrthosiphon gossypii

2.3 棉蚜和棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后解毒酶活性變化

研究表明，棉蚜體內(nèi)各解毒酶活性均高于棉長管蚜，且在取食噻蟲嗪包衣棉花后上升速度也高于棉長管蚜。在取食噻蟲嗪包衣處理棉花植株的葉片前，棉蚜AChE、CarE、CYP450、GSTs的相對活力分別為棉長管蚜的4.62、2.51、1.08、1.51倍，除CYP450外，棉蚜解毒酶的相對活力均顯著高于棉長管蚜(P<0.05)。AChE相對酶活比在取食2 g/kg處理2 h內(nèi)激增，隨后隨時間逐漸下降，最終接近CK的相對酶活比，而4 g/kg處理相對酶活比除在6 h有所下降外，其余時間均呈上升趨勢。2 和4 g/kg處理CarE相對酶活比在2 h均有所下降，4 g/kg處理隨后開始上升并趨于穩(wěn)定，而2 g/kg處理在6～12 h激增，隨后下降，并在24 h高于其它處理。棉蚜和棉長管蚜的CYP450相對酶活在取食前接近，取食4 g/kg處理后下降，24 h時小于1.00，取食2 g/kg處理6 h內(nèi)兩者相對酶活比呈上升趨勢，隨后小幅下降，兩者存在顯著差異(P<0.05)。2 g/kg處理下2種蚜蟲的GSTs相對酶活比先上升后下降，而4 g/kg處理下，不同時間點相對酶活比高于2 g/kg及CK處理，且整體呈持續(xù)上升趨勢。圖9

注：相對酶活比=棉蚜比活力/棉長管蚜比活力Note：Relative ratio=Activity of Aphis gossypii/Activity of Acyrthosiphon gossypii圖9 棉蚜和棉長管蚜的相對酶活比變化Fig.9 Change of relative ratio between Aphis gossypii and Acyrthosiphon gossypii

3 討 論

乙酰膽堿酯酶(AChE)通過催化降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，終止其對神經(jīng)突觸后膜興奮的刺激作用，以維持神經(jīng)沖動在生物體內(nèi)的正常傳遞[18]。試驗結(jié)果表明，取食噻蟲嗪包衣棉花葉片后，低劑量處理時，棉蚜AChE活性呈現(xiàn)出時間效應(yīng)，但對照處理棉蚜AChE活性有顯著上升，因此，推測這種現(xiàn)象可能是由棉蚜取食棉葉帶來的誘導(dǎo)效應(yīng)，這種現(xiàn)象與曾賢義[19]用吡蟲啉處理煙蚜，曾春祥等[20]用吡蟲啉處理桃蚜后，兩者AChE表現(xiàn)出結(jié)果一致。兩者的AChE活力比在取食不同劑量處理24 h后均有所上升，相同劑量噻蟲嗪包衣棉花后棉蚜的AChE活性更高，尤其是在高劑量下兩者酶活比的增加幅度更大，而在預(yù)試驗中，棉蚜也表現(xiàn)出了對高劑量更好的耐受性。雖然明確噻蟲嗪作用靶標為乙酰膽堿受體[21,22]，但高劑量處理和棉長管蚜取食后均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

羧酸酯酶(CarE)可將含酯鍵、酰胺鍵、硫酯鍵等的外源物質(zhì)水解為相應(yīng)的醇或酸[23]。此次試驗中噻蟲嗪低劑量處理短時對試蟲的CarE活性有持續(xù)的誘導(dǎo)作用，高劑量處理為顯著的持續(xù)抑制作用，在24 h均表現(xiàn)為顯著的抑制作用。石緒根[24]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，抗性棉蚜品系體內(nèi)的CarE表達量增加較小，與試驗中棉蚜和棉長管蚜在被處理后CarE活力比的變化結(jié)果相佐證。呂敏等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)植物次生物質(zhì)2-十三烷酮和槲皮素對棉蚜CarE分別具有顯著的誘導(dǎo)作用和劑量效應(yīng)，實驗中棉蚜對照組CarE活力也出現(xiàn)了時間上的顯著波動，并在24 h時呈現(xiàn)出顯著的提高。噻蟲嗪種子包衣棉花對蚜蟲CarE的影響是多方面綜合的復(fù)雜結(jié)果，且受到時間和劑量的影響。

細胞色素P450(CYP450)是生命體藥物代謝過程中的主要蛋白酶，因酶蛋白中血紅素與CO結(jié)合在可見光450 nm處有最大吸收峰而得名[26]。試驗中棉蚜取食高劑量、棉長管蚜取食不同劑量噻蟲嗪包衣處理植株的棉葉CYP450活力變化較小，各處理組內(nèi)不同時間點多數(shù)差異不顯著。有報道[27,28]通過測定酶抑制劑增效作用，發(fā)現(xiàn)增效醚對新煙堿類藥劑具有顯著的增效作用，說明CYP450在昆蟲在對新煙堿類藥劑產(chǎn)生抗性的過程中發(fā)揮了顯著的作用，試驗中棉蚜取食低劑量處理后體內(nèi)CYP450活性得到了顯著的升高，兩者結(jié)論一致。另有研究表明，CYP450幫助昆蟲外源毒害物質(zhì)的代謝主要是通過部分有關(guān)蛻皮激素合成基因的過表達實現(xiàn)的[24]，而試驗中選取的棉蚜均為成蚜，體內(nèi)蛻皮激素含量低，可能使噻蟲嗪對CYP450的誘導(dǎo)作用有所降低。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是昆蟲體內(nèi)參與有毒物質(zhì)代謝的一類重要酶。試驗中蚜蟲取食低劑量噻蟲嗪包衣棉花對GSTs活性表現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的時間效應(yīng)，這與袁家瑜等[29]用噻蟲嗪亞致死劑量處理月季長管蚜Macrosiphumroswomm表現(xiàn)出的時間效應(yīng)一致。與王小強等[30]用吡蟲啉亞致死劑量處理豌豆蚜Acyrthosiphonpisum24 h內(nèi)的變化也相吻合。但與對照組相比，誘導(dǎo)效應(yīng)并不顯著。此次試驗高劑量處理下2種蚜蟲均表現(xiàn)出持續(xù)的抑制作用，并且棉蚜在高劑量處理下GSTs的活力在不同時間點均高于棉長管蚜，且兩者的比值在不斷上升。史曉斌等[26]報道吡蟲啉抗性為42.19倍的棉蚜體內(nèi)GSTs活力是敏感棉蚜的1.58倍，在棉蚜對吡蟲啉的抗性產(chǎn)生中，GSTs的活力有所升高，但較為緩慢，與試驗中低劑量處理對GSTs的影響相同。GSTs可能參與棉蚜和棉長管蚜取食噻蟲嗪包衣棉花后的代謝解毒，但不是主導(dǎo)因素。

與通過亞致死劑量處理后測定昆蟲體內(nèi)酶活力不同，試驗中的蚜蟲在進行生測前不斷取食會持續(xù)吸收毒害物質(zhì)。在這個過程中，對蚜蟲產(chǎn)生脅迫的不僅有噻蟲嗪，還有棉花體內(nèi)的抗蟲物質(zhì)，以及噻蟲嗪在植物體內(nèi)的代謝物質(zhì)和棉花被噻蟲嗪誘導(dǎo)產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)都會影響昆蟲體內(nèi)酶的活性。明確噻蟲嗪包衣棉花對棉蚜和棉長管蚜解毒酶的影響，對生產(chǎn)中推廣新煙堿類藥劑種子處理棉種防治棉花蚜蟲具有一定的指導(dǎo)作用。

4 結(jié) 論

取食噻蟲嗪包衣棉花三葉期葉片，2 g/kg處理對棉蚜體內(nèi)CarE、CYP450、GSTs及棉長管蚜體內(nèi)CarE、CYP450的活性呈現(xiàn)先抑制后誘導(dǎo)的時間效應(yīng)。4 g/kg處理對2種蚜蟲各解毒酶活性均表現(xiàn)出持續(xù)的抑制作用。田間同一地塊采集蚜蟲經(jīng)實驗室篩選3代后棉蚜AChE、CarE、CYP450、GSTs的相對活力分別為棉長管蚜的4.62、2.51、1.08、1.51倍，棉田棉蚜較棉長管蚜對毒害物質(zhì)具有較強的代謝能力。