孫 波，周洪英**，吳洪麗，郭 云，郝 瑜，劉啟燕

（1．湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，湖北 武漢 430064；2．宜昌市夷陵區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖北 宜昌 443000）

桑黃（Sanghuangporus spp．）是一類珍貴的藥用真菌，Ikekawa等[1-2]于1968年首次報道桑黃提取物對小鼠肉瘤180的抑制作用為96．7%。主要活性成分有多糖類、黃酮類、三萜類、吡喃酮類、甾類、多酚類、香豆素類等，其功效包括抗腫瘤、保肝、降血糖、增強免疫力、抗氧化、抗菌、抗炎、抗誘變、抗突變、治療關(guān)節(jié)炎等[3]，且無毒副作用[4]。目前已知全世界桑黃孔菌屬（Sanghuangporus）有14種，其中中國有8種[5-6]。不同種的桑黃因寄生樹種不同，活性物質(zhì)含量差異較大，桑樹桑黃（Sanghuangporus sanghuang）子實體多糖、黃酮及三萜含量均高于其他樹種[7]。

野生桑黃人工馴化栽培研究尚處于探索階段，大多數(shù)種的桑黃人工栽培困難，產(chǎn)量低，價格昂貴，遠不能滿足國內(nèi)外市場需求，導(dǎo)致野生桑黃被掠奪性采集，資源面臨枯竭，野生資源收集研究及原產(chǎn)地保護迫在眉睫。現(xiàn)有桑黃研究多集中在功能活性及人工馴化栽培方面，而野生桑樹桑黃生境的調(diào)查鮮有報道。湖北夷陵栽桑養(yǎng)蠶歷史悠久，桑樹資源豐富，野生桑樹桑黃發(fā)生率較高，通過對湖北夷陵野生桑樹桑黃進行生境調(diào)查，為其資源保護及人工馴化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 取樣點信息

取樣點位于湖北夷陵，平均海拔800 m，據(jù)當(dāng)?shù)貧庀髷?shù)據(jù)統(tǒng)計，年降水量1 000 mm～1 300mm，5月～9月雨量集中，占全年降雨量的74%；10月～12月的降雨量占14%，1月～4月的降雨量占12%。無霜期278 d，年平均日照時數(shù)1 669．2 h。

1.2 試驗儀器

Thermo Sorvall Biofuge Primo R型高速冷凍離心機，美國Thermo公司；TaKaRa TP600型PCR儀，日本TaKaRa公司；NanoDrop2000超微量分光光度計，美國Thermo公司；ABI3730-XL型測序儀，美國Applied Biosystems公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；Taq DNA聚合酶，上海桑尼生物科技有限公司；DNA marker，日本TaKaRa公司；DL-WS210溫濕度記錄儀，杭州盡享科技有限公司；PHS-3C型酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

取樣桑園內(nèi)，以有野生桑樹桑黃發(fā)生的桑樹占桑園內(nèi)的桑樹總數(shù)的比值作為桑黃發(fā)生率；將溫度、濕度記錄儀放置在桑黃生長點附近，調(diào)查時間段為2018年6月1日至2019年5月31日，共計365 d，每小時自動記錄溫度、濕度1次。

對桑黃生長情況及生長點周圍桑樹、溫度、濕度、植物多樣性進行調(diào)查，取桑樹桑黃樹根下20 cm～30 cm處土壤，采用PHS-3C型酸度計測定土壤pH，采用重鉻酸鉀容量法測定土壤有機質(zhì)。采用Excel 2010和SAS 9．1．3軟件進行統(tǒng)計分析。DNA抽提、ITS序列PCR、測序及聚類分析參照參考文獻[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生桑黃發(fā)生狀態(tài)

在桑園內(nèi)采集野生桑樹桑黃子實體，采用組織分離法得到純培養(yǎng)菌株，經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析鑒定為桑樹桑黃（Sanghuangporus sanghuang）[9]。在調(diào)查時間段內(nèi)，對取樣桑園內(nèi)的桑樹總數(shù)和有野生桑樹桑黃發(fā)生的桑樹進行調(diào)查，根據(jù)桑黃陸續(xù)發(fā)生的數(shù)量分析得出，桑黃發(fā)生率36%～42%，桑黃與桑樹及苔蘚生長情況見圖1。

圖1 野生桑樹桑黃與桑樹及苔蘚生長情況Fig．1 Growth ofwild Sanghuangporus sanghuang,mulberry and bryophyte

由圖1所示，桑黃生長在生命力衰敗的桑樹上，位于桑樹的中下部，被雜草或苔蘚植物覆蓋的部位，一般在距地面20 cm～50 cm。在距地面20 cm左右，桑黃子實體上面褐色，附著苔蘚，邊緣和下面呈鮮黃色，雜草和苔蘚較密，呈鮮綠色。在距地面約50 cm，雜草和苔蘚較少，桑黃著生點周圍和桑黃上面苔蘚呈枯黃色，桑黃子實體呈褐色。由此可見，距地面約20 cm的溫度、濕度等條件適合桑黃和苔蘚的生長。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，距本取樣點直線距離約1 km處，有一面積約600m2的水塘用作桑樹灌溉。水塘邊桑園無楊樹等高大植物遮陰，苔蘚較少，桑樹上有野生桑樹桑黃寄生，見圖2。

圖2 水塘環(huán)境及野生桑黃在桑樹上的生長情況Fig．2 Pond environmentand growth ofwild Sanghuangporus sanghuang onmulberry

由圖2可知，該地區(qū)桑黃子實體呈棕褐色，木質(zhì)化嚴重，有類似年輪狀的特征，桑黃邊緣未見鮮黃色生長點，仍可通過組織分離得到桑黃純培養(yǎng)菌株。進一步說明，在溫度、濕度等條件適宜時，桑黃和苔蘚可恢復(fù)生長，呈現(xiàn)鮮黃色和鮮綠色。

對上述觀察點采集的6株野生桑黃菌株進行ITS聚類分析，ITS片段長度698 bp～757 bp。結(jié)果見圖3。

圖3 觀察點桑樹桑黃菌株ITS聚類分析Fig．3 ITS cluster analysis of strains atobservation points

圖3結(jié)果表明，從桑園內(nèi)采集的菌株（SH05、SH06、SH07、SH08）和水塘邊采集的菌株（SH01、SH04）與桑樹桑黃菌株（Sanghuangporus sanghuang voucher Cui14419）親緣關(guān)系接近，為桑樹桑黃，與桑黃屬其他種有區(qū)別。

2.2 桑園及桑樹生長情況

湖北夷陵野生桑樹桑黃生境及生長情況見圖4。

圖4 桑園Fig．4 Mulberry garden

由圖4可知，桑園四面環(huán)山，北高南低形成坡地，南面有山澗水流。東西長30 m，南北長10 m，面積約300 m2，桑樹60棵，品種均為湖桑32（Morus alba），是國內(nèi)推廣面積最大的桑樹品種，葉子用于飼養(yǎng)家蠶。根據(jù)葉用桑樹栽培管理方式要求，樹干高60 cm～90 cm，每年需定期剪伐枝條一次，加之桑葉采摘，使桑樹生長受到抑制，加速老化。樹齡約為20年～30年，樹干中空，病蟲害多發(fā)，發(fā)芽數(shù)和產(chǎn)葉量明顯下降，無法滿足養(yǎng)蠶生產(chǎn)需要。桑園廢棄5年～10年，間作楊樹3年～5年，株距3 m，行距4m。

桑樹喜光稍耐蔭、耐旱，不耐澇。桑樹適宜土壤pH為中性，含水率60%～80%，土質(zhì)為粘質(zhì)壤土至壤質(zhì)粘土，且排水通暢。若土壤過粘會使桑根閉氣，桑樹生命力減弱，易發(fā)生病害[10]。桑園間作楊樹5年后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，楊樹生長造成桑樹光照不足，生長受到抑制。楊樹落葉增多，土壤含水率達95%～100%，且不易蒸發(fā)。取樣桑園土壤為粘質(zhì)黃棕壤，pH 5．5～6．5。綜上所述，桑園的光照、土壤等條件不適宜桑樹的生長，促使桑樹死亡干枯，僅在桑園邊緣有個別桑樹存活。

2.3 野生桑樹桑黃生境溫濕度分析

桑黃菌絲生長最適溫度為24℃～28℃，子實體生長最適溫度為20℃～28℃，低于20℃或高于28℃生長緩慢，子實體生長最適濕度為85%以上。溫度低于15℃，濕度低于70%，桑黃菌絲、子實體生長緩慢或停滯[11]。調(diào)查時間段內(nèi)，日最高平均溫度為29．8℃，最低平均溫度為-5．6℃，最高平均濕度為100%，最低平均濕度為53．7%，年平均溫度為14．9℃，年平均濕度為 84．4%。

調(diào)查時間段內(nèi)，桑園日平均溫度、濕度變化和分析結(jié)果見圖5。

圖5 觀測時間段內(nèi)日平均溫度、濕度分析Fig．5 Analysis on daily average temperature and humidity during the observation period

觀測時間段內(nèi)日平均溫濕度分析如圖5所示，平均溫度20℃～28℃的天數(shù)達107 d，占總調(diào)查天數(shù)的29．32%，適合桑黃子實體生長。其中，平均溫度24℃～28℃的天數(shù)為54 d，占14．79%，適合桑黃菌絲及子實體生長。平均濕度85%以上的天數(shù)達184 d，占50．41%，適合桑黃的子實體生長。調(diào)查時間段內(nèi)，平均溫度低于15℃，平均濕度低于70%的天數(shù)僅為 29 d，占 7．95%。

在調(diào)查的6月～9月，日平均溫度均高于15℃，平均濕度均高于70%，為觀測時間段適合桑黃子實體生長的最長時間段。5月適合桑黃子實體生長的天數(shù)為24 d，4月和10月的天數(shù)超過10 d，分別為14 d和11 d。1月、2月、12月平均溫度低于15℃，平均濕度低于70%，不適合桑黃子實體生長。全年日平均溫度高于15℃、平均濕度高于70%的天數(shù)共185 d，其中日平均溫度高于20℃、平均濕度高于85%、最適合桑黃子實體生長的天數(shù)共62 d，其中6月～8月共52 d，為最適合的月份。

2.4 生境內(nèi)植物多樣性調(diào)查

桑樹、楊樹、苔蘚、雜草等通過生境改善、引入有益生物等形成植被群落，之間的相互作用是構(gòu)建野生桑樹桑黃生境的重要因素，對其組成和結(jié)構(gòu)有強烈的影響[12-13]。

2．4．1 楊樹及其與桑黃的關(guān)系

楊樹群落的葉面積指數(shù)和郁閉度對環(huán)境溫濕度有重要的調(diào)節(jié)作用。冠層結(jié)構(gòu)限制蒸騰作用釋放水分的散失，使群落內(nèi)濕度維持在較高的水平。郁閉度越大、葉面積指數(shù)越高，群落內(nèi)的空氣溫度就越低[14-15]。桑園間作楊樹，株距3 m，行距4 m，樹齡1年～3年，冠層結(jié)構(gòu)郁閉度較小、葉面積指數(shù)較低，群落環(huán)境適合苔蘚和桑黃的生長，同時抑制了桑樹生長。楊樹樹齡3年～5年，冠層結(jié)構(gòu)郁閉度增大、葉面積指數(shù)增高，桑樹因光照不足、土壤含水率高等原因進一步衰敗，直至死亡，在尚未干枯的桑樹上仍有個別桑黃生長。桑樹干枯后，群落溫濕度等環(huán)境因素雖然適合桑黃生長，但桑黃因缺少水分供給不再出菇生長。

2．4．2 苔蘚及其與桑黃的關(guān)系

苔蘚植物是一種結(jié)構(gòu)簡單的高等植物，是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對維持種群、群落或生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要的作用[16]。楊樹群落提供了苔蘚生長所需的散射光線或半陰環(huán)境。桑樹根部、桑黃著生部位及桑黃子實體上面布滿苔蘚，苔蘚長勢良好，同時桑黃邊緣也呈現(xiàn)生長點特有的鮮黃色。苔蘚和桑黃在相同生境中的生長狀態(tài)提示二者對生境的要求相似。桑黃子實體上面布滿苔蘚說明二者可形成共生關(guān)系[17]。

取樣點所在村隨處可見苔蘚生長，且有多處養(yǎng)蠶用老桑園，推斷該村內(nèi)發(fā)生零星野生桑樹桑黃的概率較大。

2．4．3 雜草及其與桑黃的關(guān)系

桑園內(nèi)雜草主要有狗牙根（Cynodon dactylon）、藎草 [Arthraxon hispidus(Thunb．)Makino]、霧水葛[Pouzolzia zeylanica(L．)Benn．]、馬蘭 [Kalimeris indica(Linn．)Sch．]等，桑黃發(fā)生的高度一般不超過雜草的生長高度。雜草在距地面20 cm～50 cm桑黃發(fā)生的高度范圍內(nèi)形成了小氣候環(huán)境，影響環(huán)境內(nèi)的光照和溫濕度。雜草與楊樹、苔蘚形成植被群落的高低層次生態(tài)環(huán)境，從而維持桑黃生境的穩(wěn)定。

3 討論

在桑樹上生長，形似桑黃的真菌有多種，如粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus），分布在我國多地，被當(dāng)?shù)赜米魃｜S，其生長發(fā)育規(guī)律、子實體形態(tài)特征和生長環(huán)境條件與桑樹桑黃不同[18-19]。研究中野生桑樹桑黃經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定確定為桑樹桑黃，此前未見桑樹桑黃自然生境調(diào)查報道，研究結(jié)果可為桑樹桑黃人工馴化提供參考。

調(diào)查取樣點年平均溫度14．9℃，年平均濕度84．4%。全年日平均溫度高于15℃、平均濕度高于70%的天數(shù)共185 d，其中日平均溫度高于20℃、平均濕度高于85%、最適合桑黃子實體生長的天數(shù)共62 d，6月～9月為適合桑黃子實體生長的月份。

桑黃多發(fā)生于生命力衰敗且尚未干枯的桑樹上，受到生境內(nèi)各因素的影響。因采葉養(yǎng)蠶、特定栽培管理方式及樹齡老化，桑樹樹干畸形中空，病蟲害多發(fā)，生命力衰敗，桑黃孢子容易侵入宿生。間作楊樹改變了桑園內(nèi)的光照進而改變的植被群落，與苔蘚、雜草等多種因素相互作用，影響園內(nèi)光照、通風(fēng)、溫濕度和土壤含水率等生境條件，促進桑黃的生長。經(jīng)實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在湖北竹山縣、秭歸縣、長陽縣山林中也有其他種的野生桑黃發(fā)生，如桑樹桑黃（Sanghuangporus sanghuang）、漆樹桑黃（Sanghuangporus toxicodendri）、忍冬桑黃（Sanghuangporus lonicerinus）等。其生境與本調(diào)查結(jié)論一致，均有相對高大的樹木、灌木、雜草、苔蘚形成的植被群落、光照及溫濕度環(huán)境。在相對開放或管理到位的桑園中，桑樹生長旺盛或不具備適宜生境條件，桑黃難以發(fā)生。

桑樹、楊樹、苔蘚、雜草等植物群落共同作用有助于維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，形成了適合桑黃發(fā)生生長的生境。楊樹通過葉面積指數(shù)和郁閉度調(diào)節(jié)生境的光照和溫濕度，提高了土壤含水率，抑制了桑樹的生命力，提供了苔蘚生長所需的散射光線或半陰環(huán)境。雜草和苔蘚在桑黃生長的高度內(nèi)形成了小氣候環(huán)境，與楊樹形成高低層次生態(tài)環(huán)境。苔蘚和桑黃在相同生境中生長狀態(tài)說明二者有相似的生境要求。苔蘚植物對環(huán)境變化敏感，可將苔蘚作為野生桑樹桑黃資源保護及人工馴化栽培環(huán)境研究的指示性植物，通過苔蘚植物的生長狀況判斷是否合適桑黃生長。通過控制溫度、減少日照、增加植被種類加強保濕來調(diào)整小氣候環(huán)境，有望增加桑黃發(fā)生概率。

野生桑樹桑黃資源保護迫在眉睫，人工馴化栽培有待突破，可尋找穩(wěn)定的野生桑樹桑黃生長點，并分析這些生長點之間環(huán)境條件的共性，為野生桑樹桑黃資源保護和人工馴化提供翔實的數(shù)據(jù)。研究中調(diào)查點的周年溫濕度變化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)的桑樹桑黃與桑樹、楊樹等喬木、雜草、苔蘚等植被的關(guān)系，與水源的距離等因素，有助于我們了解桑黃生長的最佳氣候環(huán)境條件，為人工馴化提供參考。人工栽培常出現(xiàn)原基不分化或原基死亡污染等問題，可參考調(diào)查中調(diào)控溫濕度、光照、通風(fēng)，把苔蘚生長狀況作為環(huán)境條件是否適合桑黃生長的觀測指標(biāo)，為桑樹桑黃生長提供良好環(huán)境。實踐證明，在部分苔蘚長勢良好的栽培大棚內(nèi)，桑黃邊緣均呈現(xiàn)生長點特有的鮮黃色，且少有污染發(fā)生。桑黃和宿主植物的相互作用，雜草和苔蘚對栽培環(huán)境及雜菌污染是否有改善作用，有待深入研究。