鄭婉錚，孫 宇，林先云，陳全助，馮錦秀，蔡 琦，馮麗貞*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2.順昌縣林業(yè)局，福建順昌 353200；3.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院，福州 350002）

無(wú)患子（Sapindus mukorossi）別名黃金樹、肥皂樹等，屬無(wú)患子科（Sapindaceae）無(wú)患子屬（Sapindus）[1]，落葉喬木，廣泛分布于我國(guó)南方。無(wú)患子用途較多，具有很高的實(shí)用價(jià)值。其樹形美觀，木質(zhì)堅(jiān)硬厚重，既可用于制作各種家具及雕刻，又可作為行道樹和庭園蔭樹[2-3]；其果皮、果實(shí)及莖中含有黃酮類化合物、脂肪酸等，不僅是天然活性香料，也有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)痛等藥效[4-6]；且果皮表面的活性成分倍半萜糖苷類和三萜皂苷類，是天然的活性劑，去污力強(qiáng)，天然無(wú)公害，已運(yùn)用至醫(yī)療及日常生活中的多個(gè)領(lǐng)域[7-8]。在順應(yīng)綠色發(fā)展的時(shí)代潮流下，無(wú)患子作為天然的洗護(hù)珍果，其生產(chǎn)發(fā)展具有廣闊前景[9]。

由于大面積純林種植，林分結(jié)構(gòu)單一，林分抗逆性差，以致無(wú)患子病害頻繁暴發(fā)。受害植株葉部干枯，甚至提早脫落，影響植株光合作用，產(chǎn)量急劇下降，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益，成為限制無(wú)患子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。目前對(duì)于無(wú)患子的病害研究大都集中在煤污病、黑星病、炭疽病、枯萎病和潰瘍病[10-13]。有鑒于此，本研究以福建省順昌縣受害無(wú)患子人工林基地采集的病樣組織為研究對(duì)象，通過(guò)組織分離法、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定，確定無(wú)患子葉斑病病原菌種類，在此基礎(chǔ)上探究病原菌生物學(xué)特性，研究結(jié)果將為無(wú)患子葉斑病的科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株的分離培養(yǎng)與純化

用組織分離法[14]對(duì)菌株進(jìn)行分離。采集具有典型葉斑病癥狀的無(wú)患子葉片，用無(wú)菌手術(shù)刀剪取病健交接處3 mm×3 mm的葉部組織，先用75%的酒精消毒30 S，5%的次氯酸鈉消毒2 min，再用無(wú)菌水漂洗4次，并置于滅菌紙上干燥后，接種至PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待葉片長(zhǎng)出菌絲時(shí)，挑取菌落邊緣的菌絲至PDA培養(yǎng)基進(jìn)行多次純化。

1.2 致病性測(cè)定

接種分為有傷接種和無(wú)傷接種，接種前將無(wú)患子離體葉片用75%的酒精進(jìn)行消毒，無(wú)菌水洗脫酒精后將葉片分為兩組。一組采用針刺法，采用無(wú)菌針頭針刺4～5個(gè)相鄰的孔，取0.6 cm的菌餅接種在傷口處。另一組直接將0.6 cm的菌餅接種至無(wú)損傷葉片，以空白PDA菌餅為對(duì)照，置于25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，逐日觀察記錄，每處理5個(gè)重復(fù)。取接種發(fā)病后的部位進(jìn)行組織分離并鏡檢觀察。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)特征觀察：將病原菌接種至PDA培養(yǎng)基上，黑暗條件下28℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察培養(yǎng)皿內(nèi)菌落的形態(tài)特征。

菌落顯微特征觀察：將病原菌接種至綜合PDA培養(yǎng)基[14]（馬鈴薯200 g取汁，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀 3 g，硫酸鎂1.5 g，水 1 000 mL）上，置于黑光燈下24 h不間斷照射，誘導(dǎo)子座產(chǎn)生后，觀察子座特征及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征。

1.4 分子生學(xué)物學(xué)鑒定

參照真菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.SP Fungal DNA mini kit）說(shuō)明書提取病原菌DNA，ITS序列擴(kuò)增引物采用ITS1/ITS2，PCR反應(yīng)體系：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性 10 s，58℃退火 15 s，72℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。測(cè)序工作委托福州白鯨生物科技有限公司完成。結(jié)合所得ITS序列的BLAST比對(duì)結(jié)果，選擇參比序列。ITS序列的系統(tǒng)親緣關(guān)系通過(guò)CLUSTAL-X軟件校正，MEGA7軟件完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.5 生物學(xué)特性研究

1.5.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

供試的7種培養(yǎng)基分別為PDA、PSA、Czapek、Bilays、WA、黃豆和淀粉瓊脂[15]，將病原菌接入不同培養(yǎng)基中央后25℃下暗培養(yǎng)7 d，菌落測(cè)量方法采用十字交叉法，各處理3次重復(fù)。

1.5.2 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

碳源真菌生理培養(yǎng)基：碳源5 g，硝酸鈉1 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，瓊脂17 g，水1 000 mL。將碳源等量替換成葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇和可溶性淀粉，將病原菌接入不同碳源培養(yǎng)基中央后25℃下暗培養(yǎng)7 d，菌落測(cè)量方法采用十字交叉法，各處理3次重復(fù)。

氮源真菌生理培養(yǎng)基：氮源1 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，葡萄糖5 g，瓊脂17 g，水1 000 mL。將氮源等量替換成硝酸鉀、氯化銨、硝酸鈉、酵母膏、磷酸氫二鉀、蛋白胨、硝酸鈣、牛肉浸膏，培養(yǎng)方法與統(tǒng)計(jì)方法同上。

1.5.3 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

設(shè)置 5、10、15、20、25、28、30 和 35 ℃共 8 個(gè)不同溫度梯度，將病原菌接入PDA平板中央后分別置于上述不同溫度培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d，菌落測(cè)量方法采用十字交叉法，各處理3次重復(fù)。

1.5.4 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

用1 mol/L的氫氧化鈉及鹽酸溶液調(diào)整PDA培養(yǎng)基 pH 值至 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 和13.0等9個(gè)不同pH值梯度，將病原菌接入不同pH值的培養(yǎng)基平板中央后，25℃下暗培養(yǎng)7 d，菌落測(cè)量方法采用十字交叉法，各處理3次重復(fù)。

1.5.5 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

3種光照條件分別為全光照、12 h光暗交替和全黑暗。將病原菌接入PDA平板中央后，不同光照條件下25℃培養(yǎng)7 d，菌落測(cè)量方法采用十字交叉法，各處理3次重復(fù)。

1.5.6 菌絲致死溫度測(cè)定

致死溫度分別設(shè)置為 37、40、45、50和 55 ℃，取病原菌菌餅置于加入無(wú)菌水的2 mL的離心管中，各溫度梯度水浴10 min后接種到PDA平板中25℃暗培養(yǎng)7 d，菌絲是否生長(zhǎng)分別用符號(hào)“+”和“-”表示，各處理3次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在Microsoft Excel 2017和SPSS 19.0中完成，經(jīng)多重比較分析不同條件下菌落生長(zhǎng)影響的相關(guān)性，顯著水平設(shè)置為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

對(duì)具有典型癥狀的無(wú)患子葉斑病觀察發(fā)現(xiàn)，該病害主要為害無(wú)患子葉片，患病初期該部位出現(xiàn)黃褐色斑點(diǎn)，后逐漸向外擴(kuò)展，形成不規(guī)則的淡褐色或深褐色的病斑，病斑上常伴有黑色小點(diǎn)（圖1A），潮濕條件下會(huì)產(chǎn)生黑色墨汁狀液體（圖1B）。

2.2 病原菌分離及致病性測(cè)定

通過(guò)組織分離法共分離出9種菌株，命名為SW-1、SW-2、SW-3、SW-4、SW-5、SW-6、SW-7、SW-8、SW-9，用離體接種對(duì)分離到的9種菌株進(jìn)行致病性測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種SW-9菌餅的無(wú)患子葉片在有傷接種與無(wú)傷接種的情況下均能產(chǎn)生黃褐色不規(guī)則病斑（圖1C、1D），其余8種菌株進(jìn)行無(wú)傷接種及有傷接種后都無(wú)典型病斑。利用組織分離法對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行再分離、純化，獲得菌株與原始菌株一致，完成柯赫氏法則，表明SW-9為致病菌株。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

菌落在PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7 d后，菌落平均直徑5.72 cm，菌落近圓形；氣生菌絲呈白色，絨毛狀平鋪（圖2A、圖2B）。培養(yǎng)15 d后，菌落鋪滿培養(yǎng)皿，菌落中心產(chǎn)生炭黑色色素，菌落背面呈淡黃色，并帶有黑色暈圈。培養(yǎng)30 d后，菌落呈炭黑色，部分表面革質(zhì)化，菌落背面無(wú)變化（圖2C、圖2D）。在綜合PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d可形成子座，子座不分枝或者分枝，圓柱形，高約0.5～2 cm；表面黑色、光滑；內(nèi)部白色（圖2E）；分生孢子器橢圓形，孔口稍微凸起，長(zhǎng)83.49～114.28μm，寬45.93～57.62μm（圖2F）；孢子橢圓狀；單孢；光滑；不等邊至稍等邊；長(zhǎng) 7～8 μm，寬 3～4 μm（圖 2G）。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)NCBI的BLAS在線工具對(duì)SW-9的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，SW-9的ITS序列與Xylaria arbuscula（JQ761007）的一致性為99.64%。為驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析，結(jié)果表明，SW-9與Xylaria arbuscula聚在同一分支，與其他種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和進(jìn)化分析，將菌株SW-9鑒定為Xylaria arbuscula。將其ITS序列提交至 GeneBank，獲得序列登錄號(hào)為 MK747250。

圖3 基于ITS序列和鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining analysis of ITS gene sequences of Xylaria arbuscula isolates

2.5 生物學(xué)特性研究結(jié)果

2.5.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

該病原菌菌絲在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度和菌落特征差異較大（見(jiàn)圖4）。菌落在PDA生長(zhǎng)最好，菌絲濃密，呈絨毛狀；其次為Czapek及PSA培養(yǎng)基，菌落特征與在PDA上的生長(zhǎng)狀態(tài)相似，但菌落生長(zhǎng)速度較慢；在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲較稀疏；在Bilays培養(yǎng)基上菌絲濃密，但生長(zhǎng)速度緩慢；在WA及黃豆培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)稀疏且緩慢。

圖4 不同培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響Figure 4 The effect of different culture media on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.2 不同碳、氮源對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響差異顯著，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。在碳素營(yíng)養(yǎng)中，菌絲對(duì)麥芽糖利用效果最好，其次為葡萄糖、果糖、可溶性淀粉，對(duì)甘露醇、蔗糖、乳糖的利用率低。在氮素營(yíng)養(yǎng)中，以蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏的利用效果好，其次為硝酸鈣、硝酸鉀，對(duì)氯化銨及硝酸鉀利用率較低。

圖5 不同碳源基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響Figure 5 The effect of carbon resources on mycelial growth of Xylaria arbuscula

圖6 不同氮源基對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響Figure 6 The effect of nitrogen resources on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.3 不同溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

由圖7可見(jiàn)，不同溫度條件對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)影響顯著。病原菌在5～35℃內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適溫度為28℃，培養(yǎng)7 d后的菌落直徑為6.16 cm，最適溫度區(qū)間為25～30℃，在5～15℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，不利于病原菌生長(zhǎng)。

圖7 不同溫度對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響Figure 7 The effect of temperature on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.4 不同pH對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

結(jié)果如圖8所示，在pH 5～13范圍內(nèi)該病原菌均可生長(zhǎng)，偏酸性條件下生長(zhǎng)狀況較好，最適生長(zhǎng)的pH范圍是6～7，7 d后菌落直徑分別為5.72 cm和5.99 cm。

圖8 不同pH值對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響Figure 8 The efffect of pH on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.5 不同光照對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

根據(jù)圖9中3種不同光照條件處理的菌落生長(zhǎng)狀況來(lái)看，24 h全黑暗條件下菌落生長(zhǎng)相對(duì)較快，菌落直徑為5.69 cm。24 h全光照與12 h/12 h光暗交替條件下菌落直徑分別為5.58 cm、5.63 cm。

圖9 不同光照條件對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響Figure 9 The effect of light on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.6 菌絲致死溫度測(cè)定

對(duì)該病原菌菌絲致死溫度測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表1，40℃以上菌絲均不能生長(zhǎng)，因此該病原菌的致死條件為40℃、10 min。

表1 菌絲致死溫度測(cè)定Table 1 The mycelial growth temperature of Xylaria arbuscula

3 討論與結(jié)論

炭角菌屬Xylaria是1789年Hill ex Schrank建立的[16]，隸屬于真菌界子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）炭角菌目（Xylariales）炭角菌科（Xylariaceae）[17]，炭角屬是炭角菌科中最大的屬，為該科的模式屬，全球有300余種[18]，目前，在中國(guó)有124種1變種1變型[19]。炭角菌的生境較廣，可生于木頭、糞便、雜物、植物種子、果實(shí)或葉片上，部分種類生于昆蟲巢上[20-21]。炭角菌屬有些種類是重要的植物病原菌，可造成重大經(jīng)濟(jì)損失，例如，由Xylaria buscula[22]引起的澳洲堅(jiān)果潰瘍病、Xylaria mali[22]引起的蘋果根腐病，以及Xylaria pedunculata[23-24]在雞腿菇等食用菌栽培中引起的病害，該菌生于栽培食用菌的覆土層上，對(duì)食用菌的栽培危害很大，輕者減產(chǎn)，重者造成絕收。關(guān)于Xylaria arbuscula引起的無(wú)患子葉斑病為首次報(bào)道。

通過(guò)對(duì)無(wú)患子葉斑病病原菌（Xylaria arbuscula）生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，該菌生長(zhǎng)的溫度范圍較廣，酸堿度的適應(yīng)能力較強(qiáng)，光照條件對(duì)該菌的生長(zhǎng)影響較小。在添加不同氮源的培養(yǎng)基中，菌絲生長(zhǎng)旺盛，表明該菌能夠較好地利用有機(jī)氮源。最有利于該菌菌絲體生長(zhǎng)的碳、氮源分別是麥芽糖、葡萄糖和蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏，最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PDA、Czapek及PSA培養(yǎng)基，且在綜合PDA上經(jīng)黑光燈照射下能較快產(chǎn)生子座，顯示該菌對(duì)綜合營(yíng)養(yǎng)的需求較高。

無(wú)患子葉斑病導(dǎo)致受害植株病葉容易脫落，病葉易隨著風(fēng)或雨傳播，導(dǎo)致附近植株或整個(gè)種植區(qū)感染，不斷擴(kuò)大葉斑病發(fā)生面積。而該病原菌（Xylaria arbuscula）適應(yīng)生長(zhǎng)的溫度范圍廣，對(duì)各pH值的適應(yīng)能力強(qiáng)，因此，應(yīng)對(duì)修剪病葉及落葉及時(shí)處理，冬季清園，避免病原菌順利越冬，來(lái)年繼續(xù)造成侵染。后續(xù)可在室內(nèi)篩選有效的化學(xué)藥劑，結(jié)合科學(xué)的營(yíng)林措施，通過(guò)綜合防治策略，有效防止無(wú)患子葉斑病，進(jìn)而有效保證無(wú)患子的質(zhì)量和產(chǎn)量。